La espectroscopia de dicroísmo circular de radiación sincrotrón , comúnmente conocida como SRCD y también conocida como dicroísmo circular VUV o espectroscopia VUVCD , es una poderosa extensión de la técnica de espectroscopia de dicroísmo circular (CD) , a menudo utilizada para estudiar propiedades estructurales de moléculas biológicas como las proteínas. y ácidos nucleicos . Los principios físicos de SRCD son esencialmente idénticos a los de CD, en el sentido de que la técnica mide la diferencia en la absorción (ΔA) de la luz polarizada circularmente izquierda (A L ) y derecha (A R ) (ΔA=A L -A R ) mediante una muestra en solución. Para obtener un espectro CD(SRCD), la muestra debe ser ópticamente activa de forma innata ( quiral ), o, de alguna manera, debe ser inducida a tener propiedades quirales, ya que sólo entonces habrá una diferencia observable en la absorción de la luz polarizada circularmente izquierda y derecha. . Las principales ventajas de SRCD sobre CD surgen de la capacidad de medir datos en un rango de longitud de onda extendido en el extremo del espectro ultravioleta del vacío (VUV). Como estas mediciones utilizan una fuente de luz con un flujo de fotones (cantidad de luz que incide en una superficie determinada) más alto que una máquina de CD de mesa, significa que los datos son más precisos en estas longitudes de onda extendidas porque hay una señal más grande sobre el ruido de fondo. (la relación señal-ruido) y, generalmente, se necesita menos muestra al registrar los espectros y hay más contenido de información disponible en los datos. [1] Actualmente existen muchas líneas de luz en todo el mundo que permiten la medición de datos SRCD.
La ampliación del rango de longitud de onda para experimentos con CD ya se había considerado e impulsado ya en 1970. Tres grupos de investigación habían creado sus propias máquinas de CD "internas", con lámparas especializadas como fuente de luz, para permitir mediciones en este rango. [2] Se había propuesto el uso de radiación sincrotrón (SR) como fuente de luz en una reunión celebrada en el Laboratorio Nacional Brookhaven en Long Island en 1972, [2] [3] sin embargo, pasaron algunos años más antes de que esto se hiciera realidad. Dos artículos de investigación de 1980 informaron sobre la recopilación de datos de CD utilizando SR como fuente de luz para los experimentos. Específicamente, los espectros se obtuvieron en regiones de longitud de onda en el rango VUV, desde ~100 nanómetros (nm) a ~200 nm, en gran medida no disponibles para los espectrofotómetros de mesa de laboratorio . Sutherland [4] y otros. Alabama. se centró en el desarrollo de un espectrofotómetro versátil capaz de medir CD, entre otras propiedades, en la región VUV del espectro, [5] [6] mientras que Snyder [7] y Rowe recogieron datos de CD de un pequeño compuesto orgánico en el rango de longitud de onda 130,5 nm a 205 nm. [8]
Como se muestra en el diagrama, se utilizan varios deflectores para eliminar la posible luz parásita que se refleja en los lados del tubo de la línea de luz. El uso de un solo espejo minimiza la pérdida de flujo de fotones, que es más importante en la región VUV, donde la reflectividad es pobre en relación con el rango de longitud de onda visible. [9]
Las primeras líneas de luz SRCD construidas inicialmente intentaron utilizar las propiedades intrínsecas de la radiación SR producida, por lo que existe un componente "central" polarizado linealmente con, encima y debajo de él, regiones igualmente opuestas de componentes polarizados circularmente. La premisa para esto era que la señal general producida a partir de una muestra quiral se vería mejorada por la diferencia de absorción (la señal) derivada de estas características polarizadas circularmente del haz. [10] En una situación ideal, este enfoque funcionaría; sin embargo, esta configuración se modificó de modo que todas las líneas de luz ahora incluyan un polarizador lineal (como se muestra) para eliminar estos componentes polarizados circularmente. Esto se debió a que incluso el más mínimo movimiento en la posición del haz (deriva del haz) conducía a una coincidencia desigual de las contribuciones de los componentes polarizados circularmente que golpeaban la muestra y esto, a su vez, significaba que la señal SRCD producida era inexacta y poco confiable; Como resultado, a menudo son irreproducibles. [10] Mientras que las máquinas CCD se purgan completamente con nitrógeno para minimizar la absorción por el oxígeno de la luz de la lámpara de arco de xenón , en una disposición SRCD el haz pasa a través de fluoruro de calcio (CaF 2 ), o "longitudes de onda VUV transparentes" similares. ", ventana donde todo lo que está antes de este punto está en el vacío y todo lo que está más allá está en nitrógeno. El haz interactúa con un modulador fotoelástico (PEM), que en consecuencia produce un haz alternado polarizado circularmente hacia la derecha y hacia la izquierda y estos ahora interactúan con la muestra. La diferencia de absorción resultante por la muestra se mide y se amplifica mediante un tubo fotomultiplicador (PMT) y a partir de este se registra el espectro SRCD. El rango de longitud de onda que se utiliza para los estudios SRCD suele estar en la región UV a VUV y puede llegar por debajo de este; potencialmente desde ~100 nm, hasta la región visible, ~400 nm. El rango exacto en el que se pueden recopilar datos depende de la configuración de la línea de luz, la preparación de la muestra y el rango de longitud de onda del detector PMT utilizado. Uno de los principales factores que limita el corte de longitud de onda inferior es que la muestra suele estar en solución, ya que existe una gran banda de absorción de agua centrada en ~167 nm. Este fondo de alta absorción inunda cualquier posibilidad de medir la señal de diferencia de CD muy pequeña, aunque el uso de agua deuterada (D 2 O) como solvente reduce la absorción del solvente aumentando el rango de recolección de datos de longitud de onda inferior en ~ 10 nm. [11] [12] Eliminar completamente el agua solvatante, creando como resultado una película, significa que los datos se pueden registrar en longitudes de onda significativamente más bajas, hasta alrededor de ~130 nm. [13]
Las principales ventajas del SRCD sobre las máquinas CCD de laboratorio surgen del uso de la emisión de luz de sincrotrón como fuente. Se encuentran varias bandas de absorción biológicamente interesantes en la región entre ~170 nm y ~350 nm. En el caso de las proteínas, estas provienen de sus estructuras secundarias y terciarias , mientras que en esta región también se encuentran las bandas estructurales de los ácidos nucleicos ( ADN y ARN ) y los sacáridos . Sin embargo, en el caso de las máquinas CCD, el flujo de fotones de la fuente se reduce en aproximadamente dos órdenes de magnitud en el rango de longitud de onda de 250 nm a 180 nm, [14] exactamente en la región de mayor importancia para estas moléculas biológicas. Por el contrario, normalmente, el flujo de fotones para una línea de luz SRCD en esta región es al menos tres órdenes de magnitud mayor que el de una máquina cCD, manteniendo ese nivel hasta ~150 nm. [14] El aumento del flujo significa que las señales medidas de la muestra aumentarán en relación con el ruido de fondo, por lo que hay una mejora significativa en la relación señal-ruido de la muestra. Esto mejorará la precisión de los datos registrados, lo que significa que la interpretación se puede realizar con más confianza en los resultados. Una ventaja adicional del aumento del flujo es que la concentración de la muestra se puede reducir manteniendo al mismo tiempo un aumento significativo en la intensidad de la señal, por lo que las muestras que son difíciles de producir en cantidad tienen más posibilidades de producir datos de CD utilizables a partir de SRCD en lugar de un cCD. máquina. El aumento del rango de longitud de onda inferior proporciona más datos espectrales para el análisis, lo que significa que hay más contenido de información [15] disponible en esos datos, lo que significa que se pueden determinar con precisión más parámetros, en este caso características de la estructura secundaria en la estructura de la proteína. [15]
Si bien los primeros informes sobre su uso datan de 1980, pasaron dos décadas más antes de que la técnica de SRCD despegara en gran parte debido al trabajo de Bonnie Wallace en Birkbeck College , Universidad de Londres . Aproximadamente desde el año 2000, sus objetivos en el campo se centraron tanto en mejorar la recopilación de datos de calidad a través de mejoras técnicas como en demostrar estudios de aplicación de "prueba de principio", que ilustran la información novedosa que ofrece SRCD. La construcción de la Fuente de Radiación Sincrotrón (SRS) de la línea de luz CD12 [14] en el Laboratorio Daresbury , inaugurada en 2005 bajo los auspicios del Centro de Estructura y Dinámica de Proteínas y Membranas (CPMSD) [1] [16] [17] de del que Wallace era director, representó la primera de las nuevas líneas de luz SRCD dedicadas de segunda generación. Rápidamente se identificó que el alto flujo de fotones de CD12 estaba causando la desnaturalización de la muestra de proteína [18] , pero que esto se podía resolver reduciendo el área de la muestra que se estaba irradiando. [19] Estudios posteriores han identificado los límites del umbral de flujo que inducen la desnaturalización de la proteína SRCD. [20] El aporte del laboratorio Wallace a los primeros años del desarrollo de SRCD también incluyó la introducción de la calibración y estandarización de los espectrofotómetros SRCD y cCD , [21] [22] la creación de software para procesar los datos espectrales usando CDtool, [23 ] y CDtoolX, [24] y analizar los datos utilizando DichroWeb, [25] [26] [27] [28] y la generación de conjuntos de datos de referencia de proteínas para respaldar estos análisis de datos. [29] [30] [31] Además, su laboratorio produjo células de muestra con longitudes de trayectoria reducidas y utilizó material (CaF 2 ) transparente a la radiación VUV, lo que mejoró significativamente la recopilación de datos en las regiones de longitud de onda inferior de SRCD. [32]
Se construyeron nuevas líneas de luz SRCD en varios sincrotrones de todo el mundo. "ASTRID".El anillo, en el Departamento de Física y Astronomía de la Universidad de Aarhus en Dinamarca , se convirtió en un sincrotrón de segunda generación dedicado en 2005. Finalmente, este anillo tenía dos líneas de luz SRCD, UV1 y CD1, que migraron al nuevo anillo de tercera generación, ASTRID2 , en 2013/14, como AU-UV y AU-CD. El sincrotrón SOLEIL , cerca de París , Francia , encargó una línea de luz SRCD dedicada, DISCO, alrededor de 2005. [33] En el Centro de Radiación Sincrotrón de Hiroshima , también conocido como HiSOR, se construyó una línea de luz VUVCD durante el mismo período, mientras que un poco más tarde, en 2009, Se puso en servicio una línea de luz SRCD en Beijing , China . Esta línea de luz en particular es única porque el sincrotrón que actúa como fuente de luz es también el anillo portador de electrones del Colisionador de Electrones y Positrones de Beijing . [34] El SRS cerró en 2008 [35] siendo reemplazado en el Reino Unido por Diamond Light Source en el que se abrió una línea de luz SRCD para su uso en 2010. [36] Con el cierre del SRS, la línea de luz CD12 SRCD se trasladó e instaló en , la Instalación de Radiación Sincrotrón ANKA (ahora llamada KARA), parte del Instituto de Tecnología de Karlsruhe (KIT), en Karlsruhe , Alemania . Esta línea de luz se abrió para los usuarios en 2011 [13] pero se cerró en 2021. Actualmente en construcción (a junio de 2023) en la fuente de luz del sincrotrón Sirius en Campinas , Brasil , se encuentra una nueva línea de luz SRCD, CEDRO. [37]
Destacar algunos de los trabajos publicados que han empleado SRCD en sus estudios de investigación ilustra mejor el poder de esta técnica.
Las cataratas son la principal causa de ceguera en los seres humanos y las mutaciones en una proteína particular, la γD- cristalina , se han relacionado con varias formas congénitas de esta enfermedad. [38] Una mutación de un aminoácido , de prolina (P) a treonina (T), en la posición 23 de la cadena polipeptídica, se ha relacionado con al menos cuatro formas diferentes de esta dolencia. Las investigaciones de SRCD se llevaron a cabo en la proteína de tipo salvaje y dos variantes, el mutante P23T encontrado en la enfermedad, y una modificación relacionada, P23S (prolina a serina , un aminoácido químicamente similar a la treonina), para establecer la naturaleza de la causa de formación de cataratas. [39] Se sugirieron dos posibles razones como factor causal; la solubilidad reducida de la proteína mutante, o una inestabilidad en la estructura de la proteína que se introduce por la mutación. Significativamente, debido a que el mutante tenía una solubilidad limitada, las máquinas de CD de laboratorio solo pudieron proporcionar espectros muy ruidosos y, como resultado, los datos no eran interpretables. Sin embargo, los espectros SRCD producidos tenían muy poco ruido asociado con sus datos, incluido el mutante, y mostraron claramente que las estructuras de la proteína de tipo salvaje, la mutante y la relacionada tenían conformaciones muy similares. Estos datos también establecieron que el mutante conservaba estabilidad ante la desnaturalización térmica, muy similar a la de la proteína de tipo salvaje. Los datos confirmaron que el factor causante de las cataratas fue la reducción de la solubilidad asociada con la mutación P23T y no los cambios en la estabilidad de la proteína. [39]
Debido al alto grado de flexibilidad, resultó difícil determinar la estructura del dominio C-terminal extramembranoso de los canales de sodio dependientes de voltaje bacterianos . Utilizando una serie de canales sintetizados donde este dominio C-terminal había sido truncado, en algunos casos por una diferencia de un solo aminoácido entre las construcciones , el laboratorio de Wallace utilizó SRCD para identificar con éxito la estructura de esta región. [40]
Las proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP) tienen una estructura innata muy limitada en solución, pero adquieren forma específicamente cuando interactúan con moléculas asociadas, como proteínas o ARN ; sin embargo, su estructura resultante suele estar dictada por esta interacción. Además, algunas proteínas tienen secciones de secuencia sin estructura, denominadas regiones intrínsecamente desordenadas (IDR), que también adquieren estructura tras la interacción. Tener diferentes formas con diferentes socios significa que son funcional y estructuralmente flexibles, lo que los hace de importancia central para las vías de señalización [41] y como factores de regulación/control [42], por ejemplo. Los IDP (y los IDR si pueden aislarse del resto de la proteína) tienen una apariencia espectral SRCD distintiva en solución, lo que significa que los cambios en sus espectros que surgen a través de interacciones ofrecen una oportunidad ideal para obtener información sobre lo que está sucediendo tanto estructural como funcionalmente. . Además, los estudios SRCD han demostrado que cuando se elimina el agua de solvatación de estas proteínas, generando una película, hay una ganancia en la estructura y se pueden medir más bandas de transición de CD en la región de longitud de onda VUV inferior porque la banda de absorción de agua no está presente. [43]
La mielina es la vaina aislante que se forma en los sistemas nerviosos central (SNC) y periférico (SNP) para rodear los axones de las células nerviosas , aumentando y manteniendo así el impulso eléctrico, el potencial de acción , enviado a lo largo de ellos. Formada principalmente por lípidos , hay proteínas específicas dentro de los componentes de la mielina cuyas funciones son estructurar la mielina en capas unidas. Dos de estas proteínas son la proteína básica de mielina (MBP), una IDP principalmente en el SNC, y la proteína de mielina cero (P0), que contiene una sección IDR (P0ct) y es clave en el SNP. MBP y P0ct se emplearon en un estudio [44] que utilizó datos SRCD como factor clave para establecer si había alguna importancia en las predicciones de sus estructuras proteicas IDP e IDR generadas por Alphafold2 , un programa de inteligencia artificial desarrollado por DeepMind . PDB2CD, [45] un paquete que genera espectros SRCD a partir de coordenadas atómicas de proteínas, se utilizó para calcular espectros de las estructuras Alphafold2, y luego estos espectros se compararon con los espectros experimentales SRCD recopilados de las proteínas MBP y P0ct en diversas condiciones ambientales; estados de solución, detergente y ligados a lípidos. El estudio informó que, a partir de las comparaciones SRCD, las estructuras predichas por Alphafold2 para MBP y P0ct tenían un gran parecido con aquellas cuando estaban unidas a la membrana lipídica. [44]
Una característica importante encontrada en las estructuras de las proteínas es la adición de azúcares ( glucosilación ) a residuos de aminoácidos específicos mediante modificación postraduccional . A estos sitios se pueden conectar estructuras complejas de azúcar, lo que puede modificar sustancialmente las propiedades de estas proteínas, una de las principales razones de su presencia. Los azúcares adjuntos pueden ayudar a plegar algunas proteínas a su forma correcta; por lo tanto, afectar la estructura de una proteína es un resultado posible. SRCD es ideal para determinar cualquier diferencia conformacional que pueda surgir directamente de diferentes entornos ambientales debido al rango de longitud de onda extendido en la región VUV, que proporciona un mayor contenido de información. Sin embargo, los azúcares unidos pueden contribuir a la señal SRCD porque sus transiciones están ubicadas más hacia el extremo VUV del espectro. Esto significa que, como resultado, su presencia puede causar un problema a la hora de obtener una medida precisa del contenido de estructura secundaria de la proteína. Matsuo. [46] y Gekko produjeron el estudio histórico de los espectros VUVCD de sacáridos seleccionados, demostrando así que las glicoproteínas contribuirían a sus espectros a partir de su contenido de azúcar. [47] A partir de este y otros estudios [48] demostraron que las características espectrales SRCD que surgieron de los azúcares podrían atribuirse a muchos factores dentro de sus conformaciones: la configuración del grupo hidroxilo alrededor del átomo C1 del sacárido (conformación alfa o beta , o casi axial o ecuatorial al plano del anillo de azúcar respectivamente), la posición axial o ecuatorial de los grupos hidroxilo restantes, la naturaleza trans o gauche del grupo hidroximetilo C5 y el enlace glicosídico (ya sea 1-4 o 1- 6) entre monómeros de azúcar. Utilizando esta información, el grupo de Wallace investigó la glicosilación del canal de sodio dependiente de voltaje en experimentos que se basaban en el hecho de que un espectro CD(SRCD) de una mezcla de componentes es la suma de todos los componentes presentes. [49] El objetivo fue establecer si existían diferencias en la estructura tridimensional del canal con y sin azúcares adheridos a la estructura; ¿La glicosilación jugó algún papel importante en la función de estos canales cuando se unieron azúcares? Se recogieron tres conjuntos experimentales de espectros SRCD; las estructuras de canal glicosiladas y no glicosiladas y otro de los componentes de azúcar aislados que se combinaron para formar los unidos al canal. Quitando el espectro del canal no glicosilado del del glicosilado, demostraron que el espectro de diferencia resultante correspondía al de los componentes del azúcar. Esto significaba que no había diferencias estructurales entre las estructuras de los canales glicosilados y no glicosilados, por lo que la unión del azúcar no desempeñaba un papel clave en su función [49]
Estudiado por primera vez en 2010 mediante este método, [50] una investigación reciente [51] utilizó SRCD para examinar las diferencias en la estructura en solución y en la interfaz aceite-agua, de péptidos derivados de algas, bacterias y patatas como posibles agentes emulsionantes. De los estudiados, el péptido de bacterias demostró ser el más eficaz como agente emulsionante y compuesto antioxidante estabilizador. [51]
Existen o se están construyendo (a partir de 2023) varias líneas de luz SRCD [actualizar]en todo el mundo, como se enumera en la tabla.
a A partir de 2022, los componentes de la antigua línea de luz SRCD CD12 [13] (en KARA) ahora están instalados en la línea de luz DISCO.
b Esta instalación también funciona como parte del Colisionador de Electrones y Positrones de Beijing (BEPC) [34]
c Existen dos módulos (A y B) en esta línea de luz
d Esta línea de luz está en construcción y recibió su "primera luz" en junio de 2023 [63]