Un constructo de ADN es un segmento de ADN diseñado artificialmente que se encuentra en un vector y que se puede utilizar para incorporar material genético en un tejido o célula objetivo . [1] Un constructo de ADN contiene un inserto de ADN , llamado transgén , que se administra a través de un vector de transformación que permite que la secuencia del inserto se replique y/o se exprese en la célula objetivo. Este gen se puede clonar a partir de un gen natural, [2] o construirse sintéticamente. [3] El vector se puede administrar mediante métodos físicos, químicos o virales. [4] Normalmente, los vectores utilizados en los constructos de ADN contienen un origen de replicación , un sitio de clonación múltiple y un marcador seleccionable . [2] Ciertos vectores pueden llevar elementos reguladores adicionales según el sistema de expresión involucrado. [5]
Los constructos de ADN pueden ser tan pequeños como unos pocos miles de pares de bases (kbp) de ADN que transportan un solo gen, utilizando vectores como plásmidos o bacteriófagos , o tan grandes como cientos de kbp para estudios genómicos a gran escala utilizando un cromosoma artificial. [2] Un constructo de ADN puede expresar una proteína de tipo salvaje, prevenir la expresión de ciertos genes expresando competidores o inhibidores, o expresar proteínas mutantes, como mutaciones por deleción o mutaciones sin sentido . Los constructos de ADN se adaptan ampliamente en la investigación de biología molecular para técnicas como la secuenciación de ADN, la expresión de proteínas y los estudios de ARN. [5]
El primer vector estandarizado, pBR220, fue diseñado en 1977 por investigadores del laboratorio de Herbert Boyer. El plásmido contiene varios sitios de enzimas de restricción y un gen de resistencia a antibióticos estable libre de actividades de transposón. [6]
En 1982, Jeffrey Vieira y Joachim Messing describieron el desarrollo de vectores pUC derivados de M13mp7 que consisten en un sitio de clonación múltiple y permiten una secuenciación y clonación más eficientes utilizando un conjunto de cebadores universales M13. Tres años después, los mismos científicos diseñaron el plásmido pUC19, que actualmente es popular. [7]
El gen de una secuencia de ADN de interés puede clonarse a partir de una secuencia existente o desarrollarse sintéticamente. Para clonar una secuencia que se encuentra de forma natural en un organismo, primero se corta el ADN del organismo con enzimas de restricción , que reconocen secuencias de ADN y las cortan, alrededor del gen objetivo. Luego, el gen puede amplificarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Por lo general, este proceso incluye el uso de secuencias cortas conocidas como cebadores para hibridar inicialmente con la secuencia objetivo; además, se pueden introducir mutaciones puntuales en las secuencias de cebadores y luego copiarlas en cada ciclo para modificar la secuencia objetivo. [2]
También es posible sintetizar una cadena de ADN diana para un constructo de ADN. Se pueden desarrollar cadenas cortas de ADN conocidas como oligonucleótidos mediante síntesis en columna, en la que se añaden bases una a la vez a una cadena de ADN unida a una fase sólida. Cada base tiene un grupo protector para evitar la unión que no se elimina hasta que la siguiente base está lista para añadirse, lo que garantiza que estén unidas en la secuencia correcta. Los oligonucleótidos también se pueden sintetizar en una micromatriz, lo que permite sintetizar decenas de miles de secuencias a la vez, con el fin de reducir los costes. [3] Para sintetizar un gen más grande, se desarrollan oligonucleótidos con secuencias superpuestas en los extremos y luego se unen. El método más común se llama ensamblaje cíclico de la polimerasa (PCA): los fragmentos se hibridan en las regiones superpuestas y se extienden, y se crean fragmentos más grandes en cada ciclo. [2]
Una vez que se ha aislado una secuencia, se debe insertar en un vector . La forma más fácil de hacerlo es cortar el ADN del vector utilizando enzimas de restricción; si se utilizaron las mismas enzimas para aislar la secuencia objetivo, se crearán las mismas secuencias "salientes" en cada extremo, lo que permitirá la hibridación. Una vez que el gen objetivo se ha hibridado con el ADN del vector, se pueden unir utilizando una ADN ligasa . [2] Una estrategia alternativa utiliza la recombinación entre sitios homólogos en el gen objetivo y la secuencia del vector, eliminando la necesidad de enzimas de restricción. [8]
Existen tres categorías generales de administración de construcciones de ADN: físicas, químicas y virales. [4] Los métodos físicos, que administran el ADN penetrando físicamente la célula, incluyen la microinyección , la electroporación y la biolística . [9] Los métodos químicos se basan en reacciones químicas para administrar el ADN e incluyen la transformación con células que se vuelven competentes utilizando fosfato de calcio, así como la administración mediante nanopartículas lipídicas. [10] [11] Los métodos virales utilizan una variedad de vectores virales para administrar el ADN, incluidos el adenovirus , el lentivirus y el virus del herpes simple [12]
Además del gen diana, hay tres elementos importantes en un vector: un origen de replicación, un marcador seleccionable y un sitio de clonación múltiple. Un origen de replicación es una secuencia de ADN que inicia el proceso de replicación del ADN, lo que permite que el vector se clone a sí mismo. Un sitio de clonación múltiple contiene sitios de unión para varias enzimas de restricción, lo que facilita la inserción de diferentes secuencias de ADN en el vector. Un marcador seleccionable confiere algún rasgo que se puede seleccionar fácilmente en una célula huésped, de modo que se puede determinar si la transformación fue exitosa. Los marcadores seleccionables más comunes son los genes de resistencia a los antibióticos, de modo que las células huésped sin el constructo morirán cuando se expongan al anticuerpo y solo permanecerán las células huésped con el constructo. [2]
Los constructos de ADN se pueden utilizar para producir proteínas, tanto proteínas naturales como proteínas mutantes modificadas genéticamente. Estas proteínas se pueden utilizar para elaborar productos terapéuticos, como fármacos y anticuerpos. Los constructos de ADN también pueden cambiar los niveles de expresión de otros genes mediante la expresión de secuencias reguladoras, como promotores e inhibidores. Además, los constructos de ADN se pueden utilizar para la investigación, como la creación de bibliotecas genómicas, la secuenciación de ADN clonado y el estudio de la expresión de ARN y proteínas. [5]