El enfoque isoeléctrico ( IEF ), también conocido como electroenfoque , es una técnica para separar diferentes moléculas por diferencias en su punto isoeléctrico (pI). [1] [2] Es un tipo de electroforesis zonal que generalmente se realiza en proteínas en un gel y que aprovecha el hecho de que la carga general de la molécula de interés es función del pH de su entorno. [3]
IEF implica agregar una solución de anfolito a geles de gradiente de pH inmovilizados (IPG). Los IPG son una matriz de gel de acrilamida copolimerizada con el gradiente de pH, lo que da como resultado gradientes completamente estables, excepto los valores de pH más alcalinos (>12). El gradiente de pH inmovilizado se obtiene mediante el cambio continuo en la proporción de inmovilinas . Una immobilina es un ácido o base débil definido por su valor de pK.
Una proteína que se encuentra en una región de pH por debajo de su punto isoeléctrico (pI) estará cargada positivamente y, por lo tanto, migrará hacia el cátodo (electrodo cargado negativamente). Sin embargo, a medida que migra a través de un gradiente de pH creciente, la carga general de la proteína disminuirá hasta que la proteína alcance la región de pH que corresponde a su pI. En este punto no tiene carga neta y por lo tanto cesa la migración (ya que no hay atracción eléctrica hacia ninguno de los electrodos). Como resultado, las proteínas se concentran en bandas estacionarias nítidas y cada proteína se ubica en un punto del gradiente de pH correspondiente a su pI. La técnica es capaz de lograr una resolución extremadamente alta con proteínas que se diferencian por una sola carga y se fraccionan en bandas separadas.
Las moléculas a concentrar se distribuyen sobre un medio que tiene un gradiente de pH (generalmente creado por anfolitos alifáticos ). Una corriente eléctrica pasa a través del medio, creando un ánodo "positivo" y un extremo cátodo "negativo" . Las moléculas cargadas negativamente migran a través del gradiente de pH en el medio hacia el extremo "positivo", mientras que las moléculas cargadas positivamente se mueven hacia el extremo "negativo". A medida que una partícula se mueve hacia el polo opuesto a su carga, se mueve a través del gradiente de pH cambiante hasta llegar a un punto en el que se alcanza el pH del punto isoeléctrico de esa molécula. En este punto, la molécula ya no tiene carga eléctrica neta (debido a la protonación o desprotonación de los grupos funcionales asociados) y, como tal, no continuará dentro del gel. El gradiente se establece antes de agregar las partículas de interés sometiendo primero a electroforesis una solución de moléculas pequeñas, como polianfolitos con valores de pI variables.
El método se aplica particularmente a menudo en el estudio de proteínas , que se separan según su contenido relativo de residuos ácidos y básicos , cuyo valor está representado por el pI. Las proteínas se introducen en un gel con gradiente de pH inmovilizado compuesto de poliacrilamida , almidón o agarosa donde se ha establecido un gradiente de pH. Generalmente se utilizan geles con poros grandes en este proceso para eliminar cualquier efecto de "tamizado" o artefactos en el pI causados por diferentes tasas de migración para proteínas de diferentes tamaños. El enfoque isoeléctrico puede resolver proteínas que difieren en el valor de pI en tan sólo 0,01. [4] El enfoque isoeléctrico es el primer paso en la electroforesis en gel bidimensional , en la que las proteínas se separan primero por su valor pI y luego se separan por peso molecular mediante SDS-PAGE . El enfoque isoeléctrico, por otro lado, es el único paso en la PAGE nativa preparativa a pH constante. [5]
Según algunas opiniones, [6] [7] las células eucariotas vivas realizan un enfoque isoeléctrico de proteínas en su interior para superar una limitación de la velocidad de reacción metabólica por difusión de enzimas y sus reactivos, y para regular la velocidad de procesos bioquímicos particulares. Al concentrar las enzimas de vías metabólicas particulares en regiones pequeñas y distintas de su interior, la célula puede aumentar la velocidad de vías bioquímicas particulares en varios órdenes de magnitud. Mediante la modificación del punto isoeléctrico (pI) de las moléculas de una enzima mediante, por ejemplo, fosforilación o desfosforilación, la célula puede transferir moléculas de la enzima entre diferentes partes de su interior, para activar o desactivar procesos bioquímicos particulares.
La electroforesis basada en microchips es una alternativa prometedora a la electroforesis capilar, ya que tiene el potencial de proporcionar un análisis rápido de proteínas, una integración sencilla con otras operaciones unitarias de microfluidos, detección de canales completos, películas de nitrocelulosa, tamaños de muestra más pequeños y menores costos de fabricación.
La mayor demanda de herramientas de separación de proteínas más rápidas y fáciles de usar ha acelerado la evolución de IEF hacia separaciones en solución. En este contexto, se desarrolló un sistema IEF de uniones múltiples para realizar separaciones IEF rápidas y sin gel. El sistema IEF de uniones múltiples utiliza una serie de vasos con un capilar que pasa a través de cada vaso. [8] Parte del capilar de cada vaso se reemplaza por una membrana semipermeable. Los recipientes contienen soluciones tampón con diferentes valores de pH, de modo que se establece efectivamente un gradiente de pH dentro del capilar. La solución tampón en cada recipiente tiene un contacto eléctrico con un divisor de voltaje conectado a una fuente de alimentación de alto voltaje, que establece un campo eléctrico a lo largo del capilar. Cuando se inyecta una muestra (una mezcla de péptidos o proteínas) en el capilar, la presencia del campo eléctrico y el gradiente de pH separan estas moléculas según sus puntos isoeléctricos. El sistema IEF de uniones múltiples se ha utilizado para separar mezclas de péptidos trípticos para proteómica bidimensional [9] y proteínas del plasma sanguíneo de pacientes con enfermedad de Alzheimer para el descubrimiento de biomarcadores. [8]