La activación de CRISPR ( CRISPRa ) es una técnica de regulación genética que utiliza una forma modificada del sistema CRISPR-Cas9 para mejorar la expresión de genes específicos sin alterar la secuencia de ADN subyacente. A diferencia del sistema CRISPR-Cas9 tradicional, que introduce roturas de doble cadena para editar genes, CRISPRa emplea un Cas9 modificado y catalíticamente inactivo (dCas9) fusionado con activadores transcripcionales para dirigirse a regiones promotoras o potenciadoras , lo que aumenta la transcripción genética . Este método permite un control preciso de la expresión genética, lo que lo convierte en una herramienta valiosa para estudiar la función genética, crear redes reguladoras genéticas y desarrollar posibles intervenciones terapéuticas para una variedad de enfermedades. [1]
Al igual que en el caso de la interferencia CRISPR , el efector CRISPR es guiado hacia el objetivo por un ARN guía complementario. Sin embargo, los sistemas de activación CRISPR se fusionan con activadores transcripcionales para aumentar la expresión de genes de interés. Dichos sistemas se pueden utilizar para muchos fines, incluidos, entre otros, los análisis genéticos y la sobreexpresión de proteínas de interés. El efector más utilizado se basa en Cas9 (de los sistemas de tipo II), pero también se han utilizado otros efectores como Cas12a (tipo V). [2]
La endonucleasa Cas9 muerta, también conocida como Cas9 muerta o dCas9 , es una forma mutante de Cas9 cuya actividad endonucleasa se elimina a través de mutaciones puntuales en sus dominios endonucleasa. De manera similar a su forma no mutada, dCas9 se utiliza en sistemas CRISPR junto con ARNg para dirigirse a genes específicos o nucleótidos complementarios al ARNg con secuencias PAM que permiten que Cas9 se una. Cas9 normalmente tiene 2 dominios endonucleasa llamados dominios RuvC y HNH. Las mutaciones puntuales D10A y H840A cambian 2 residuos importantes para la actividad endonucleasa que finalmente resulta en su desactivación. Aunque dCas9 carece de actividad endonucleasa, todavía es capaz de unirse a su ARN guía y a la cadena de ADN que se está dirigiendo porque dicha unión es manejada por otros dominios. Esto por sí solo suele ser suficiente para atenuar, o incluso bloquear por completo, la transcripción del gen objetivo si el ARNg posiciona a dCas9 de una manera que impide que los factores de transcripción y la ARN polimerasa accedan al ADN. Sin embargo, esta capacidad de unirse al ADN también se puede aprovechar para la activación, ya que dCas9 tiene regiones modificables, normalmente los extremos N y C de la proteína, que se pueden utilizar para unir activadores de la transcripción. [3]
Un ARN guía pequeño ( sgRNA ), o gRNA, es un ARN con alrededor de 20 nucleótidos que se utiliza para dirigir Cas9 o dCas9 a sus objetivos. Los gRNA contienen dos regiones principales de importancia para los sistemas CRISPR: las regiones de andamiaje y espaciadora. La región espaciadora tiene nucleótidos que son complementarios a los que se encuentran en los genes objetivo, a menudo en la región promotora . La región de andamiaje es responsable de la formación de un complejo con (d)Cas9. Juntos, se unen a (d)Cas9 y lo dirigen al gen o genes de interés. Dado que la región espaciadora de un gRNA se puede modificar para cualquier secuencia potencial, le da a los sistemas CRISPR mucha más flexibilidad ya que cualquier gen y nucleótido con una secuencia complementaria a la región espaciadora puede convertirse en posibles objetivos. [3]
Ver: Activador transcripcional , Factor de transcripción
Los activadores transcripcionales son dominios proteicos o proteínas completas unidas a dCas9 o sgRNA que ayudan en el reclutamiento de cofactores importantes, así como de la ARN polimerasa para la transcripción del gen o genes a los que se dirige el sistema. Para que una proteína se fabrique a partir del gen que la codifica, la ARN polimerasa debe fabricar ARN a partir de la plantilla de ADN del gen durante un proceso llamado transcripción. Los activadores transcripcionales tienen un dominio de unión al ADN y un dominio para la activación de la transcripción. El dominio de activación puede reclutar factores de transcripción generales o ARN polimerasa a la secuencia del gen. Los dominios de activación también pueden funcionar facilitando la transcripción por ARN polimerasas bloqueadas, y en eucariotas pueden actuar para mover nucleosomas en el ADN o modificar histonas para aumentar la expresión génica. [4] Estos activadores pueden introducirse en el sistema a través de la unión a dCas9 o al sgRNA. Algunos investigadores han observado que el grado de regulación positiva de la transcripción se puede modular utilizando múltiples sitios para la unión del activador en un experimento y utilizando diferentes variaciones y combinaciones de activadores a la vez en un experimento o muestra determinados. [5] [6] [7]
Se requiere un sistema de expresión para la introducción de los ARNg y las proteínas (d)Cas9 en las células de interés. Las opciones que se emplean habitualmente incluyen, entre otras, plásmidos y vectores virales, como el vector del virus adenoasociado (AAV) o el vector del lentivirus .
El activador VP64-p65-Rta, o VPR, de dCas9 se creó modificando un activador dCas9 existente, en el que se une un activador transcripcional Vp64 al extremo C de dCas9. [1] En la proteína dCas9-VPR, los factores de transcripción p65 y Rta se añaden al extremo C de dCas9-Vp64. Por lo tanto, los tres factores de transcripción están dirigidos al mismo gen. El uso de tres factores de transcripción, en lugar de solo Vp64, da como resultado una mayor expresión de los genes diana. Cuando dCas9 se dirigió a diferentes genes, todos mostraron una expresión significativamente mayor con dCas9-VPR que con dCas9-VP64. También se ha demostrado que dCas9-VPR se puede utilizar para aumentar la expresión de múltiples genes dentro de la misma célula colocando múltiples sgRNA en la misma célula. [8]
Se ha utilizado dCas9-VPR para activar los genes de neurogenina 2 (enlace) y de diferenciación neurogénica 1 (enlace), lo que da como resultado la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas en neuronas inducidas . [8] Un estudio que comparó los activadores de dCas9 descubrió que los activadores VPR, SAM y Suntag funcionaron mejor con dCas9 para aumentar la expresión genética en una variedad de tipos de células de moscas de la fruta , ratones y humanos . [9]
Para superar la limitación del sistema de activación del gen dCas9-VP64, se desarrolló el sistema dCas9-SAM para incorporar múltiples factores de transcripción. Utilizando las proteínas MS2 , p65 y HSF1 , el sistema dCas9-SAM recluta varios factores de transcripción que trabajan sinérgicamente para activar el gen de interés.
Para ensamblar diferentes activadores transcripcionales, el sistema dCas9-SAM utiliza un ARN guía único modificado (sgRNA) que tiene sitios de unión para la proteína MS2. Los aptámeros en forma de horquilla se unen al bucle tetra y al bucle de tallo 2 del sgRNA para convertirse en sitios de unión para las proteínas de la cubierta del bacteriófago MS2 dimerizadas. A medida que las horquillas se exponen fuera del complejo dCas9-sgRNA, otros factores transcripcionales pueden unirse a la proteína MS2 sin alterar el complejo dCas9-sgRNA. Por lo tanto, la proteína MS2 está diseñada para incluir las proteínas p65 y HSF1. La proteína de fusión MS2-p65-HSF1 interactúa con dCas9-VP64 para reclutar más factores transcripcionales en el promotor de los genes objetivo.
Utilizando el sistema dCas-SAM, Zhang et al. (2015) reactivaron con éxito el gen latente del VIH para sobreexpresar proteínas virales de las células huésped del VIH. [10] Pudieron sobreexpresar proteínas virales sustancialmente para desencadenar la apoptosis de las células latentes del VIH-1 debido a la toxicidad de las proteínas virales. En otro experimento del sistema dCas-SAM, Konermann et al. (2015) encontraron genes en células de melanoma que dan resistencia a un inhibidor de BRAF mediante la activación de genes candidatos mediante el sistema dCas. [7] Por lo tanto, el sistema dCas9-SAM puede emplearse además para activar genes latentes, desarrollar terapias genéticas y descubrir nuevos genes.
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El sistema activador SunTag utiliza la proteína dCas9, que está modificada para unirse con SunTag. SunTag es una matriz de polipéptidos repetitivos que puede reclutar múltiples copias de anticuerpos . Al unir factores de transcripción a los anticuerpos, el complejo activador SunTag dCas9 amplifica su reclutamiento de factores de transcripción. Para guiar la proteína dCas9 a su gen objetivo, el sistema dCas9 SunTag utiliza sgRNA .
A Tanenbaum et al. (2014) se les atribuye la creación del sistema dCas9 SunTag. [11] Para los anticuerpos , emplearon anticuerpos GCN4 que se unieron al factor de transcripción VP64. Para transportar los anticuerpos a los núcleos de las células, adjuntaron la etiqueta NLS . Para confirmar la localización nuclear de los anticuerpos, se utilizó sfGFP con fines de visualización. Por lo tanto, se desarrolló la proteína GCN4-sfGFP-NLS-VP64 para interactuar con el sistema dCas SunTag. Los anticuerpos se unieron con éxito a los polipéptidos SunTag y activaron el gen CXCR4 diana en las líneas celulares K562. [11] En comparación con el complejo de activación dCas9-VP64, pudieron aumentar la expresión del gen CXCR4 entre 5 y 25 veces más en las líneas celulares K562. No solo hubo una mayor sobreexpresión de la proteína CXCR4, sino que también las proteínas CXCR4 estaban activas para viajar más en el ensayo de migración transwell. De esta forma, el sistema dCas9-SunTag se puede utilizar para activar genes que están presentes de forma latente, como los genes de los virus.
El sistema de activación dCas9 permite que se exprese un gen deseado o varios genes en la misma célula. Es posible estudiar los genes implicados en un determinado proceso mediante un cribado de todo el genoma que implica la activación de la expresión de genes. Examinar qué sgRNA producen un fenotipo sugiere qué genes están implicados en una vía específica. El sistema de activación dCas9 se puede utilizar para controlar exactamente qué células se activan y en qué momento se produce la activación. Se han creado construcciones dCas9 que activan una proteína de fusión dCas9-activador en presencia de luz o sustancias químicas. Las células también se pueden reprogramar o diferenciar de un tipo celular a otro aumentando la expresión de ciertos genes importantes para la formación o el mantenimiento de un tipo celular. [12]
Un grupo de investigación utilizó un sistema en el que dCas9 se fusionó a un dominio particular, C1B1. Cuando se ilumina la célula con luz azul, el dominio criptocromo 2 (Cry2) se une a C1B1. El dominio Cry2 se fusiona a un activador transcripcional , por lo que la luz azul dirige el activador al punto donde está unido dCas9. El uso de luz permite un gran control sobre cuándo se activa el gen objetivo. Eliminar la luz de la célula da como resultado que solo dCas9 permanezca en el gen objetivo, por lo que la expresión no aumenta. De esta manera, el sistema es reversible. [13] Se desarrolló un sistema similar utilizando control químico. En este sistema, dCas9 recluta una proteína de fusión MS2 que contiene el dominio FKBP. En presencia del químico RAP, un dominio FRB fusionado a un complejo modificador de cromatina se une a FKBP. Siempre que se agrega RAP a las células, se puede dirigir un complejo modificador de cromatina específico al gen. Esto permite a los científicos examinar cómo las modificaciones específicas de la cromatina afectan la expresión de un gen. [14] El sistema dCAs9-VPR se utiliza como activador al dirigirlo al promotor de un gen aguas arriba de la región codificante. Un estudio utilizó varios sgRNA para dirigirse a diferentes porciones del gen, y descubrió que el activador dCas9-VPR puede actuar como activador o represor, dependiendo de la ubicación a la que se une. En una célula, los sgRNA que se dirigen al promotor podrían permitir que dCas9-VPR aumente la expresión, mientras que los sgRNA que se dirigen a la región codificante del gen hacen que dCas9-VPR disminuya la expresión. [15]
La versatilidad de los sgRNA permite que los activadores de dCas9 aumenten la expresión de cualquier gen dentro del genoma de un organismo. Esto podría usarse para aumentar la expresión de un gen codificador de proteínas o un ARN transcrito. Un artículo demostró que la activación de todo el genoma podría usarse para determinar qué proteínas están involucradas en la resistencia mediada a un fármaco específico. [7] Otro artículo utilizó la activación de todo el genoma de ARN largos no codificantes y observó que el aumento de la expresión de ciertos ARN largos no codificantes confería resistencia al fármaco vemurafenib. [16] En ambos casos, las células que sobreviven al fármaco podrían estudiarse para determinar qué sgRNA contienen. Esto permite a los investigadores determinar qué gen se activó en cada célula superviviente, lo que sugiere qué genes son importantes para la resistencia a ese fármaco.
Una fusión de dCas9 con VP64, p65 y HSF1 (factor de choque térmico 1) permitió a los investigadores dirigirse a genes en Arabidopsis thaliana y aumentar la transcripción a un nivel similar al que se produce cuando el gen se inserta en el genoma de la planta. En uno de los dos genes analizados, el activador de dCas9 cambia el número y el tamaño de las hojas y hace que las plantas sean más capaces de soportar la sequía. Los autores concluyen que el activador de dCas9 puede crear fenotipos en plantas similares a los observados cuando se inserta un transgén para su sobreexpresión. [17] Los investigadores han utilizado múltiples ARN guía para dirigir el sistema de activación de dCas9 a múltiples genes en una cepa específica de ratón en la que dCas9 se puede activar en líneas celulares específicas utilizando el sistema de recombinasa Cre . Los científicos utilizaron la orientación y el aumento de la expresión de varios genes para examinar los procesos implicados en la regeneración y los carcinomas del hígado . [18]