CLOCK ( acrónimo de circadian locomotora output cycles kaput ) es un gen que codifica un factor de transcripción básico hélice-bucle-hélice - PAS que se sabe que afecta tanto la persistencia como el período de los ritmos circadianos .
Las investigaciones muestran que el gen CLOCK desempeña un papel importante como activador de elementos posteriores en la vía crítica para la generación de ritmos circadianos . [5] [6]
El gen CLOCK fue identificado por primera vez en 1997 por Joseph Takahashi y sus colegas. Takahashi utilizó un cribado de mutagénesis directa de ratones tratados con N-etil-N-nitrosourea para crear e identificar mutaciones en genes clave que afectan ampliamente la actividad circadiana. [7] Los mutantes CLOCK descubiertos a través del cribado mostraron un período anormalmente largo de actividad diaria. Este rasgo resultó ser hereditario . Los ratones criados para ser heterocigotos mostraron períodos más largos de 24,4 horas en comparación con el período de control de 23,3 horas. Los ratones homocigotos para la mutación mostraron períodos de 27,3 horas, pero finalmente perdieron toda la ritmicidad circadiana después de varios días en oscuridad constante. [8] Esto demostró que los "genes CLOCK intactos " son necesarios para la función circadiana normal de los mamíferos, ya que estas mutaciones eran semidominantes. [8]
Se ha descubierto que la proteína CLOCK desempeña un papel central como factor de transcripción en el marcapasos circadiano. [9] En Drosophila , la proteína CLOCK (CLK) recién sintetizada se hipofosforila en el citoplasma antes de entrar en el núcleo. Una vez en los núcleos, la CLK se localiza en focos nucleares y luego se redistribuye de forma homogénea. La proteína CYCLE (CYC) (también conocida como dBMAL para el ortólogo BMAL1 en mamíferos) se dimeriza con la CLK a través de sus respectivos dominios PAS . Este dímero luego recluta la proteína de unión a CREB (CBP) coactivadora y se fosforila aún más. [10] Una vez fosforilado, este complejo CLK-CYC se une a los elementos E-box de los promotores de period (per) y timeless (tim) a través de su dominio bHLH, lo que provoca la estimulación de la expresión génica de per y tim . Un gran exceso molar de proteínas de período (PER) y atemporal (TIM) provoca la formación del heterodímero PER-TIM que evita que el heterodímero CLK-CYC se una a las cajas E de per y tim , bloqueando esencialmente la transcripción de per y tim . [6] [11] La CLK se hiperfosforila cuando la quinasa de doble tiempo (DBT) interactúa con el complejo CLK-CYC de una manera dependiente de PER, desestabilizando tanto a CLK como a PER, lo que lleva a la degradación de ambas proteínas. [11] La CLK hipofosforilada luego se acumula, se une a las cajas E de per y tim y activa su transcripción una vez más. [11] Este ciclo de fosforilación postraduccional sugiere que la fosforilación temporal de CLK ayuda en el mecanismo de sincronización del reloj circadiano. [10]
Un modelo similar se encuentra en ratones, en los que BMAL1 dimeriza con CLOCK para activar la transcripción de per y criptocromo ( cry ). Las proteínas PER y CRY forman un heterodímero que actúa sobre el heterodímero CLOCK-BMAL para reprimir la transcripción de per y cry . [12] El heterodímero CLOCK:BMAL1 funciona de manera similar a otros complejos activadores de la transcripción; CLOCK:BMAL1 interactúa con los elementos reguladores de E-box. Las proteínas PER y CRY se acumulan y dimerizan durante la noche subjetiva, y se translocan al núcleo para interactuar con el complejo CLOCK:BMAL1, inhibiendo directamente su propia expresión. Esta investigación se ha realizado y validado mediante análisis cristalográfico. [13]
CLOCK exhibe actividad de histona acetil transferasa (HAT), que se mejora mediante la dimerización con BMAL1. [14] El Dr. Paolo Sassone-Corsi y sus colegas demostraron in vitro que la actividad de HAT mediada por CLOCK es necesaria para rescatar los ritmos circadianos en mutantes Clock. [14]
El dímero CLOCK-BMAL participa en la regulación de otros genes y circuitos de retroalimentación. Una enzima SIRT1 también se une al complejo CLOCK-BMAL y actúa para suprimir su actividad, tal vez mediante la desacetilación de Bmal1 y las histonas circundantes . [15] Sin embargo, el papel de SIRT1 todavía es controvertido y también puede tener un papel en la desacetilación de la proteína PER, dirigiéndola hacia su degradación. [16]
El dímero CLOCK-BMAL actúa como una rama positiva de un ciclo de retroalimentación. La unión de CLOCK-BMAL a un elemento promotor de la caja E activa la transcripción de genes de reloj como per 1, 2 y 3 y tim en ratones. Se ha demostrado en ratones que CLOCK-BMAL también activa el gen de la nicotinamida fosforribosiltransferasa (también llamado Nampt ), parte de un ciclo de retroalimentación separado. Este ciclo de retroalimentación crea un oscilador metabólico. El dímero CLOCK-BMAL activa la transcripción del gen Nampt , que codifica la proteína NAMPT. NAMPT es parte de una serie de reacciones enzimáticas que convierten la niacina (también llamada nicotinamida ) en NAD . SIRT1, que requiere NAD para su actividad enzimática, luego usa niveles aumentados de NAD para suprimir BMAL1 a través de la desacetilación. Esta supresión da como resultado una menor transcripción del gen NAMPT, una menor producción de proteína NAMPT, una menor producción de NAD y, por lo tanto, una menor producción de SIRT1 y una menor supresión del dímero CLOCK-BMAL. Este dímero puede volver a activar positivamente la transcripción del gen Nampt y el ciclo continúa, creando otro bucle oscilatorio que involucra a CLOCK-BMAL como elementos positivos. El papel clave que desempeña Clock en los bucles metabólicos y circadianos resalta la estrecha relación entre el metabolismo y los relojes circadianos. [17]
Los primeros ritmos circadianos fueron probablemente generados por ciclos de división celular impulsados por la luz en especies procariotas ancestrales . [18] Este protorritmo evolucionó más tarde hasta convertirse en un reloj autosuficiente a través de la duplicación genética y la divergencia funcional de los genes del reloj. Los grupos de genes kaiA / B / C siguen siendo los más antiguos de los genes del reloj, ya que están presentes en las cianobacterias , y es muy probable que kai C sea el ancestro de kai A y kai B. [18] La función de estos genes del reloj ancestrales estaba probablemente relacionada con la función cromosómica antes de desarrollar un mecanismo de sincronización. [18] Los genes kai A y kai B surgieron después de que las cianobacterias se separaran de otros procariotas. [19] Las duras condiciones climáticas en la historia temprana de la formación de la Tierra, como la irradiación UV, pueden haber llevado a la diversificación de los genes del reloj en los procariotas en respuesta a cambios drásticos en el clima. [19]
Los criptocromos , proteínas sensibles a la luz reguladas por genes Cry , son probablemente descendientes de kaiC resultantes de una duplicación del genoma anterior a la explosión cámbrica y son responsables de la regulación negativa de los relojes circadianos. Otros linajes distintos de genes del reloj surgieron temprano en la evolución de los vertebrados, con el gen BMAL1 parálogo a CLOCK. Sin embargo, su ancestro común probablemente precedió a la división insecto-vertebrado aproximadamente 500 millones de años atrás. [18] WC1, un análogo de CLOCK/BMAL1 encontrado en genomas fúngicos, es un candidato propuesto como ancestro común anterior a la división hongo-animal . [18] Una búsqueda BLAST realizada en una revisión de 2004 de la evolución del gen del reloj sugirió que el gen Clock puede haber surgido de una duplicación en el gen BMAL1, aunque esta hipótesis sigue siendo especulativa. [18] Otra teoría propone alternativamente el gen NPAS2 como el parálogo de CLOCK que desempeña un papel similar en la vía del ritmo circadiano pero en diferentes tejidos. [20]
Se ha planteado la hipótesis de que las variaciones alélicas en el gen Clock1a en particular tienen efectos en el tiempo estacional según un estudio de 2014 realizado en una población de peces ciprínidos. [21] Los polimorfismos en el gen afectan principalmente la longitud de la región del dominio PolyQ, lo que proporciona un ejemplo de evolución divergente donde las especies que comparten un nicho ecológico dividirán los recursos en entornos estacionalmente variables. [21] La longitud del dominio PolyQ está asociada con cambios en el nivel de transcripción de CLOCK. En promedio, las longitudes de alelos más largas se correlacionaron con especies derivadas recientemente y especies que desovan antes, muy probablemente debido a cambios estacionales en la temperatura del agua. [21] Los investigadores plantean la hipótesis de que la longitud del dominio puede servir para compensar los cambios de temperatura al alterar la tasa de transcripción de CLOCK. Todos los demás aminoácidos permanecieron idénticos en las especies nativas, lo que indica que la restricción funcional puede ser otro factor que influye en la evolución del gen CLOCK además de la duplicación y diversificación de genes . [20] [21]
Un estudio de 2017 que investigó el papel de la expresión de CLOCK en las neuronas determinó su función en la regulación de las redes transcripcionales que podrían proporcionar información sobre la evolución del cerebro humano. [22] Los investigadores sintetizaron neuronas humanas diferenciadas in vitro y luego realizaron la eliminación de genes para probar el efecto de CLOCK en la señalización celular neuronal. Cuando se interrumpió la actividad de CLOCK, se observó un aumento de la migración neuronal de tejido en el neocórtex , lo que sugiere un mecanismo molecular para la expansión cortical exclusivo del desarrollo del cerebro humano. [22] Sin embargo, aún queda por determinar el papel preciso de CLOCK en la regulación metabólica de las neuronas corticales. Otro estudio que analizó la relación entre los polimorfismos de CLOCK en la región flanqueante 3' y la preferencia por la mañana/noche en adultos encontró una correlación entre los sujetos con el alelo 3111C y la preferencia por las horas de la noche según las respuestas proporcionadas en un cuestionario calificado. [23] Esta región está bien conservada entre ratones y humanos y se ha demostrado que los polimorfismos afectan la estabilidad del ARNm, lo que indica que las variantes alélicas podrían alterar los patrones circadianos normales en los mamíferos y provocar afecciones como el insomnio u otros trastornos del sueño. [23]
Los organismos mutantes Clock pueden poseer una mutación nula o un alelo antimórfico en el locus Clock que codifica un antagonista de la proteína de tipo salvaje. La presencia de una proteína antimórfica regula negativamente los productos transcripcionales que normalmente son regulados positivamente por Clock . [24]
En Drosophila , Allada, Hall y Rosbash identificaron una forma mutante de Clock ( Jrk ) en 1998. El equipo utilizó genética directa para identificar ritmos no circadianos en moscas mutantes. Jrk resulta de un codón de parada prematuro que elimina el dominio de activación de la proteína CLOCK. Esta mutación causa efectos dominantes: la mitad de las moscas heterocigotas con este gen mutante tienen un período alargado de 24,8 horas, mientras que la otra mitad se vuelve arrítmica. Las moscas homocigotas pierden su ritmo circadiano. Además, los mismos investigadores demostraron que estas moscas mutantes expresan niveles bajos de proteínas PER y TIM, lo que indica que Clock funciona como un elemento positivo en el bucle circadiano. Si bien la mutación afecta el reloj circadiano de la mosca, no causa ningún defecto fisiológico o de comportamiento. [25] La secuencia similar entre Jrk y su homólogo de ratón sugiere que los componentes comunes del ritmo circadiano estaban presentes tanto en los ancestros de Drosophila como de los ratones. Un alelo recesivo de Clock provoca arritmia conductual y mantiene oscilaciones moleculares y transcripcionales detectables. Esto sugiere que Clk contribuye a la amplitud de los ritmos circadianos. [26]
El homólogo murino del mutante Jrk es el mutante ClockΔ19 que posee una deleción en el exón 19 del gen Clock . Esta mutación dominante negativa da como resultado un dímero CLOCK-BMAL defectuoso, que hace que los ratones tengan una capacidad reducida para activarse por transcripción. En oscuridad constante, los ratones ClockΔ19 heterocigotos para el alelo mutante Clock presentan períodos circadianos más prolongados, mientras que los ratones ClockΔ19/Δ19 homocigotos para el alelo se vuelven arrítmicos. [8] Tanto en heterocigotos como en homocigotos, esta mutación también produce períodos más prolongados y arritmicidad a nivel de células individuales. [27]
Los ratones mutantes sin Clock -/- , en los que se ha eliminado Clock , muestran ritmos circadianos completamente normales. El descubrimiento de un mutante sin Clock con un fenotipo de tipo salvaje desafió directamente la premisa ampliamente aceptada de que Clock es necesario para la función circadiana normal. Además, sugirió que el dímero CLOCK-BMAL1 no necesita existir para modular otros elementos de la vía circadiana. [28] La proteína 2 que contiene el dominio PAS neuronal ( NPAS2 , un parálogo de CLOCK [29] ) puede sustituir a CLOCK en estos ratones sin Clock . Los ratones con un alelo NPAS2 mostraron períodos más cortos al principio, pero un comportamiento arrítmico final. [30]
En los humanos, un polimorfismo en Clock , rs6832769, puede estar relacionado con el rasgo de personalidad amabilidad . [31] Otro polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en Clock , 3111C, asociado con la preferencia diurna , [23] también está asociado con un mayor insomnio , [32] dificultad para perder peso, [33] y recurrencia de episodios depresivos mayores en pacientes con trastorno bipolar . [34]
En ratones, Clock se ha relacionado con trastornos del sueño , metabolismo , embarazo y trastornos del estado de ánimo . Los ratones mutantes Clock duermen menos que los ratones normales cada día. [35] Los ratones también muestran niveles alterados de glucosa plasmática y ritmos en la ingesta de alimentos. [36] Estos mutantes desarrollan síntomas de síndrome metabólico con el tiempo. [36] Además, los mutantes Clock demuestran ciclos estrales interrumpidos y mayores tasas de fracaso del embarazo a término. [37] Clock mutante también se ha relacionado con síntomas similares al trastorno bipolar en ratones, incluyendo manía y euforia . [38] Los ratones mutantes Clock también exhiben una mayor excitabilidad de las neuronas de dopamina en los centros de recompensa del cerebro. [39] Estos resultados han llevado a Colleen McClung a proponer el uso de ratones mutantes Clock como modelo para los trastornos del estado de ánimo y del comportamiento humanos.
También se ha demostrado que el dímero CLOCK-BMAL activa el receptor alfa de erb inverso ( Rev-ErbA alfa ) y el receptor huérfano de ácido retinoico alfa ( ROR-alfa ). REV-ERBα y RORα regulan Bmal uniéndose a los elementos de respuesta del receptor huérfano relacionados con el ácido retinoico (RORE) en su promotor. [40] [41]
Las variaciones en la epigenética del gen Clock pueden conducir a un mayor riesgo de cáncer de mama . [42] Se encontró que en mujeres con cáncer de mama, había significativamente menos metilación de la región promotora Clock . También se observó que este efecto era mayor en mujeres con tumores negativos al receptor de estrógeno y progesterona. [43]
El gen CLOCK también puede ser un objetivo para mutaciones somáticas en cánceres colorrectales con inestabilidad de microsatélites . En un estudio, el 53% de los casos de cáncer colorrectal con inestabilidad de microsatélites contenían mutaciones somáticas CLOCK. [44] La investigación naciente en la expresión de genes circadianos en tejido adiposo sugiere que la supresión del gen CLOCK puede correlacionarse causalmente no solo con la obesidad, sino también con la diabetes tipo 2, [45] con respuestas físicas cuantitativas a la ingesta de alimentos circadianos como posibles entradas al sistema de reloj. [46]