Enzima que sintetiza ARN a partir de una plantilla de ARN.
La ARN polimerasa dependiente de ARN ( RdRp ) o ARN replicasa es una enzima que cataliza la replicación del ARN a partir de una plantilla de ARN. En concreto, cataliza la síntesis de la cadena de ARN complementaria a una plantilla de ARN determinada. Esto contrasta con las típicas ARN polimerasas dependientes de ADN , que todos los organismos utilizan para catalizar la transcripción del ARN a partir de una plantilla de ADN .
La RdRp es una proteína esencial codificada en los genomas de la mayoría de los virus que contienen ARN y que carecen de una etapa de ADN, [1] [2] incluido el SARS-CoV-2 . Algunos eucariotas también contienen RdRp, que están involucradas en la interferencia del ARN y difieren estructuralmente de las RdRp virales.
Historia
Las RdRp virales se descubrieron a principios de la década de 1960 a partir de estudios sobre el mengovirus y el virus de la polio, cuando se observó que estos virus no eran sensibles a la actinomicina D , un fármaco que inhibe la síntesis de ARN dirigida por el ADN celular. Esta falta de sensibilidad sugirió la acción de una enzima específica del virus que podría copiar el ARN a partir de una plantilla de ARN. [3]
Distribución
Las RdRp están altamente conservadas en los virus y están relacionadas con la telomerasa , aunque la razón de esto fue una pregunta en curso hasta 2009. [4] La similitud llevó a la especulación de que las RdRp virales son ancestrales a la telomerasa humana. [5]
El ejemplo más famoso de RdRp se encuentra en el virus de la polio . El genoma viral está compuesto de ARN, que ingresa a la célula a través de endocitosis mediada por receptores . A partir de ahí, el ARN actúa como plantilla para la síntesis de ARN complementario. La cadena complementaria actúa como plantilla para la producción de nuevos genomas virales que se empaquetan y se liberan de la célula listos para infectar más células huésped. La ventaja de este método de replicación es que no hay ninguna etapa de ADN que complique la replicación. La desventaja es que no hay disponible una copia de ADN de "respaldo". [6]
Muchos eucariotas tienen RdRps que están involucrados en la interferencia de ARN : estos amplifican microARN y ARN temporales pequeños y producen ARN bicatenario utilizando ARN interferentes pequeños como cebadores. [8] Estos RdRps se utilizan en los mecanismos de defensa y pueden ser apropiados por virus de ARN. [9] Su historia evolutiva es anterior a la divergencia de los principales grupos eucariotas. [10]
Replicación
La RdRp se diferencia de la ARN polimerasa dependiente de ADN en que cataliza la síntesis de ARN de cadenas complementarias a una plantilla de ARN determinada. El proceso de replicación del ARN es un mecanismo de cuatro pasos:
Unión del trifosfato de nucleósido (NTP): inicialmente, la RdRp presenta un sitio activo vacante en el que se une un NTP, complementario al nucleótido correspondiente en la cadena molde. La unión correcta del NTP hace que la RdRp experimente un cambio conformacional. [11]
Cierre del sitio activo: el cambio conformacional, iniciado por la unión correcta de NTP, da como resultado la restricción del acceso al sitio activo y produce un estado catalíticamente competente. [11]
Formación de enlaces fosfodiéster : dos iones Mg2 + están presentes en el estado catalíticamente activo y se organizan alrededor de la cadena de ARN recién sintetizada de modo que el sustrato NTP experimenta una transferencia de fosfatidilo y forma un enlace fosfodiéster con la nueva cadena. [12] Sin el uso de estos iones Mg2 + , el sitio activo ya no es catalíticamente estable y el complejo RdRp cambia a una conformación abierta. [12]
Translocación: una vez que el sitio activo está abierto, la cadena de plantilla de ARN se mueve una posición a través del complejo proteico RdRp y continúa la elongación de la cadena uniéndose a un nuevo NTP, a menos que la plantilla especifique lo contrario. [11]
La síntesis de ARN puede realizarse mediante un mecanismo independiente del cebador ( de novo ) o un mecanismo dependiente del cebador que utiliza un cebador ligado al genoma de la proteína viral (VPg). [13] La iniciación de novo consiste en la adición de un NTP al 3'-OH del primer NTP iniciador. [13] Durante la siguiente fase de elongación, esta reacción de transferencia de nucleotidilo se repite con NTP posteriores para generar el producto de ARN complementario. La terminación de la cadena de ARN naciente producida por RdRp no se conoce por completo, sin embargo, la terminación de RdRp es independiente de la secuencia. [14]
Una desventaja importante de la replicación de la ARN polimerasa dependiente de ARN es la tasa de error de transcripción. [13] Las RdRps carecen de fidelidad del orden de 10 4 nucleótidos, lo que se cree que es un resultado directo de una corrección de pruebas inadecuada. [13] Esta tasa de variación es favorecida en los genomas virales ya que permite que el patógeno supere las defensas del huésped tratando de evitar la infección, lo que permite el crecimiento evolutivo. [15]
Estructura
Descripción general de la estructura RdRp del flavivirus basada en NS5Pol del virus del Nilo Occidental (WNV)
La RdRp viral/procariota, junto con muchas DdRp de subunidad única, emplean un pliegue cuya organización se ha vinculado a la forma de una mano derecha con tres subdominios denominados dedos, palma y pulgar. [16] Solo el subdominio de la palma, compuesto por una lámina beta antiparalela de cuatro cadenas con dos hélices alfa , está bien conservado. En RdRp, el subdominio de la palma comprende tres motivos bien conservados (A, B y C). El motivo A (Dx(4,5)-D) y el motivo C (GDD) están yuxtapuestos espacialmente; los residuos de ácido aspártico de estos motivos están implicados en la unión de Mg 2+ y/o Mn 2+ . El residuo de asparagina del motivo B está involucrado en la selección de trifosfatos de ribonucleósido sobre dNTP y, por lo tanto, determina si se sintetiza ARN en lugar de ADN. [17] La organización de dominios [18] y la estructura 3D del centro catalítico de una amplia gama de RdRps, incluso aquellos con una homología de secuencia general baja, se conservan. El centro catalítico está formado por varios motivos que contienen residuos de aminoácidos conservados. [ cita requerida ]
La interferencia de ARN eucariota requiere una RdRp celular (c RdRp). A diferencia de las polimerasas "manuales", se parecen a las DdRP multisubunitarias simplificadas, específicamente en las subunidades catalíticas β/β', en el sentido de que utilizan dos conjuntos de barriles β de doble psi en el sitio activo. QDE1 ( Q9Y7G6 ) en Neurospora crassa , que tiene ambos barriles en la misma cadena, [19] es un ejemplo de dicha enzima ac RdRp. [20] Los homólogos bacteriófagos de c RdRp, incluido el DdRp yonO ( O31945 ) de cadena simple similar , parecen estar más cerca de las c RdRps que las DdRP. [8] [21]
Virus
Estructura y evolución de RdRp en virus ARN y sus superfamilias
Cuatro superfamilias de virus cubren todos los virus que contienen ARN sin etapa de ADN:
Virus que contienen ARN de cadena positiva o ARN de doble cadena, excepto retrovirus y Birnaviridae
Todos los virus eucariotas de ARN de cadena positiva sin etapa de ADN, como Coronaviridae
Todos los bacteriófagos que contienen ARN ; las dos familias de bacteriófagos que contienen ARN son Fiersviridae (fagos de ARNss positivos) y Cystoviridae (fagos de ARNds)
Los flavivirus producen una poliproteína a partir del genoma del ARN monocatenario. La poliproteína se divide en varios productos, uno de los cuales es NS5, una RdRp. Posee regiones cortas y motivos homólogos a otras RdRp. [22]
Las replicasas de ARN que se encuentran en los virus ssRNA de cadena positiva están relacionadas entre sí y forman tres grandes superfamilias. [23] La replicasa de ARN birnaviral es única porque carece del motivo C (GDD) en la palma. [24] La RdRp mononegaviral (PDB 5A22) se ha clasificado automáticamente como similar a las RdRp (+)−ssRNA, específicamente una de Pestivirus y una de Leviviridae . [25] El monómero RdRp bunyaviral (PDB 5AMQ) se asemeja al complejo heterotrimérico de la RdRp ortomixoviral (Influenza; PDB 4WSB). [26]
Dado que es una proteína universal para los virus que contienen ARN, RdRp es un marcador útil para comprender su evolución. [27] [28]
Recombinación
Al replicar su genoma (+)ssRNA , el RdRp del poliovirus es capaz de llevar a cabo la recombinación . La recombinación parece ocurrir por un mecanismo de elección de copia en el que el RdRp cambia las plantillas (+)ssRNA durante la síntesis de la cadena negativa. [29] La frecuencia de recombinación está determinada en parte por la fidelidad de la replicación de RdRp. [30] Las variantes de RdRp con alta fidelidad de replicación muestran una recombinación reducida, y las RdRp de baja fidelidad exhiben una recombinación aumentada. [30] La recombinación por cambio de cadena de RdRp ocurre con frecuencia durante la replicación en los carmovirus y tombusvirus de plantas (+)ssRNA . [31]
Complementación intragénica
El virus Sendai (familia Paramyxoviridae ) tiene un genoma de ARN lineal, monocatenario, de sentido negativo y no segmentado. El RdRp viral consta de dos subunidades codificadas por el virus, una más pequeña, P, y una más grande, L. Al probar diferentes mutantes inactivos de RdRp con defectos a lo largo de la longitud de la subunidad L en combinaciones por pares, se observó la restauración de la síntesis de ARN viral en algunas combinaciones. [32] Esta interacción positiva L–L se conoce como complementación intragénica e indica que la proteína L es un oligómero en el complejo de la ARN polimerasa viral. [ cita requerida ]
Terapias farmacológicas
Las RdRp se pueden utilizar como dianas farmacológicas para patógenos virales, ya que su función no es necesaria para la supervivencia eucariota. Al inhibir la función de RdRp, no se pueden replicar nuevos ARN a partir de una cadena de ARN molde, sin embargo, la ARN polimerasa dependiente de ADN sigue siendo funcional.
El trifosfato GS-441524 es un sustrato para RdRp, pero no para las polimerasas de mamíferos. Produce una terminación prematura de la cadena y la inhibición de la replicación viral. El trifosfato GS-441524 es la forma biológicamente activa de remdesivir. Remdesivir se clasifica como un análogo de nucleótido que inhibe la función de RdRp al unirse covalentemente e interrumpir la terminación del ARN naciente a través de una terminación temprana o tardía o evitando una mayor elongación del polinucleótido de ARN. [34] [35] Esta terminación temprana conduce a un ARN no funcional que se degrada a través de procesos celulares normales.
Interferencia de ARN
El uso de RdRp juega un papel importante en la interferencia de ARN en eucariotas, un proceso utilizado para silenciar la expresión génica a través de pequeños ARN interferentes ( siRNA ) que se unen al ARNm volviéndolos inactivos. [36] El RdRp eucariota se activa en presencia de dsRNA y está menos distribuido que otros componentes de RNAi, ya que se pierde en algunos animales, aunque todavía se encuentra en C. elegans , P. tetraurelia , [37] y plantas . [38] Esta presencia de dsRNA desencadena la activación de los procesos de RdRp y RNAi al preparar el inicio de la transcripción de ARN a través de la introducción de siRNA. [37] En C. elegans , los siRNA se integran en el complejo de silenciamiento inducido por ARN, RISC , que funciona junto con los ARNm dirigidos a la interferencia para reclutar más RdRps para sintetizar más siRNA secundarios y reprimir la expresión génica. [39]
^ Consulte el clan Pfam para otras familias (+)ssRNA/dsRNA.
^ Una polimerasa de (−)ssRNA.
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