La eliminación de genes (también conocida como deleción o inactivación de genes ) es una técnica de ingeniería genética ampliamente utilizada que implica la eliminación o inactivación dirigida de un gen específico dentro del genoma de un organismo. Esto se puede hacer a través de una variedad de métodos, incluida la recombinación homóloga , CRISPR-Cas9 y TALEN .
Una de las principales ventajas de la eliminación de genes es que permite a los investigadores estudiar la función de un gen específico in vivo y comprender el papel del gen en el desarrollo y la fisiología normales, así como en la patología de las enfermedades. Al estudiar el fenotipo del organismo con el gen eliminado, los investigadores pueden obtener información sobre los procesos biológicos en los que participa el gen.
Existen dos tipos principales de knockouts genéticos: completos y condicionales. Un knockout genético completo inactiva permanentemente el gen, mientras que un knockout genético condicional permite que el gen se active y desactive en momentos específicos o en tejidos específicos. Los knockouts condicionales son particularmente útiles para estudiar los procesos de desarrollo y para comprender el papel de un gen en tipos de células o tejidos específicos.
La eliminación de genes se ha utilizado ampliamente en muchos organismos diferentes, entre ellos, bacterias, levaduras, moscas de la fruta, peces cebra y ratones. En ratones, la eliminación de genes se utiliza habitualmente para estudiar la función de genes específicos en el desarrollo, la fisiología y la investigación del cáncer.
El uso de genes knockout en modelos de ratón ha sido particularmente valioso en el estudio de enfermedades humanas. Por ejemplo, los genes knockout en ratones se han utilizado para estudiar el papel de genes específicos en el cáncer, trastornos neurológicos, trastornos inmunológicos y trastornos metabólicos.
Sin embargo, la eliminación de genes también tiene algunas limitaciones. Por ejemplo, la pérdida de un solo gen puede no imitar por completo los efectos de un trastorno genético, y la eliminación puede tener efectos no deseados en otros genes o vías. Además, la eliminación de genes no siempre es un buen modelo para las enfermedades humanas, ya que el genoma del ratón no es idéntico al genoma humano y la fisiología del ratón es diferente de la fisiología humana.
La técnica KO es esencialmente lo opuesto a un knock-in de genes . La eliminación simultánea de dos genes en un organismo se conoce como doble knock-out ( DKO ). De manera similar, los términos triple knock-out ( TKO ) y cuádruple knock-out ( QKO ) se utilizan para describir tres o cuatro genes eliminados, respectivamente. Sin embargo, es necesario distinguir entre KO heterocigotos y homocigotos . En el primero, solo se elimina una de las dos copias de genes ( alelos ), en el segundo se eliminan ambas.
Los knockouts se logran mediante una variedad de técnicas. Originalmente, se identificaban las mutaciones que ocurrían de manera natural y luego había que establecer la pérdida o inactivación de genes mediante secuenciación de ADN u otros métodos. [1]
La eliminación de genes por mutación es una técnica que se lleva a cabo habitualmente en bacterias. En 1989, Hamilton et al. publicaron un ejemplo temprano del uso de esta técnica en Escherichia coli . [2] En este experimento, se utilizaron dos recombinaciones secuenciales para eliminar el gen. Este trabajo estableció la viabilidad de eliminar o reemplazar un gen funcional en bacterias. Desde entonces, ese método se ha desarrollado para otros organismos, en particular animales de investigación, como los ratones. Los ratones knockout se utilizan habitualmente para estudiar genes con equivalentes humanos que pueden tener importancia para las enfermedades. Un ejemplo de un estudio que utiliza ratones knockout es una investigación de las funciones de las proteínas Xirp en el síndrome de muerte súbita nocturna inexplicada (SUNDS) y el síndrome de Brugada en la población Han china. [3]
Para las investigaciones de eliminación de genes, la interferencia de ARN (RNAi), un método más reciente, también conocido como silenciamiento génico, ha ganado popularidad. En la interferencia de ARN (RNAi), el ARN mensajero de un gen en particular se inactiva utilizando ARN interferente pequeño (siRNA) o ARN de horquilla corta (shRNA). Esto impide de manera efectiva la expresión del gen. Los oncogenes como Bcl-2 y p53, así como los genes vinculados a enfermedades neurológicas, trastornos genéticos e infecciones virales, han sido objeto de silenciamiento génico utilizando interferencia de ARN (RNAi). [ cita requerida ]
La recombinación homóloga es el intercambio de genes entre dos cadenas de ADN que incluyen extensas regiones de secuencias de bases que son idénticas entre sí. En las especies eucariotas, las bacterias y algunos virus, la recombinación homóloga ocurre espontáneamente y es una herramienta útil en la ingeniería genética. La recombinación homóloga, que tiene lugar durante la meiosis en los eucariotas, es esencial para la reparación de las roturas de la doble cadena de ADN y promueve la variación genética al permitir el movimiento de la información genética durante el cruce cromosómico. La recombinación homóloga, un mecanismo clave de reparación del ADN en las bacterias, permite la inserción de material genético adquirido a través de la transferencia horizontal de genes y la transformación en ADN. La recombinación homóloga en los virus influye en el curso de la evolución viral. La recombinación homóloga, un tipo de selección de genes utilizada en la ingeniería genética, implica la introducción de una mutación diseñada en un gen particular para aprender más sobre la función de ese gen. Este método implica la inserción de ADN extraño en una célula que tiene una secuencia similar al gen objetivo mientras está flanqueada por secuencias que son las mismas aguas arriba y aguas abajo del gen objetivo. El ADN del gen objetivo se sustituye con la secuencia de ADN extraño durante la replicación cuando la célula detecta las regiones flanqueantes similares como homólogas. El gen objetivo es "eliminado" por el intercambio. Al utilizar esta técnica para seleccionar alelos particulares en células madre embrionarias en ratones, es posible crear ratones knockout. Con la ayuda de la selección de genes, se han desactivado numerosos genes de ratón, lo que llevó a la creación de cientos de modelos de ratón distintos de varias enfermedades humanas, como cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares y trastornos neurológicos. [ cita requerida ] Mario Capecchi, Sir Martin J. Evans y Oliver Smithies realizaron una investigación pionera sobre la recombinación homóloga en células madre de ratón, y compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 2007 por sus hallazgos. [ 4 ] Tradicionalmente, la recombinación homóloga era el método principal para causar un knockout genético. Este método implica la creación de un constructo de ADN que contiene la mutación deseada. Para fines de knockout, esto generalmente implica un marcador de resistencia a fármacos en lugar del gen knockout deseado. [5] El constructo también contendrá un mínimo de 2 kb de homología con la secuencia objetivo. El constructo se puede administrar a las células madre mediante microinyección o electroporación . Este método se basa entonces en los propios mecanismos de reparación de la célula para recombinar el constructo de ADN en el ADN existente. Esto da como resultado que se altere la secuencia del gen y, en la mayoría de los casos, el gen se traducirá .en una proteína no funcional , si es que se traduce. Sin embargo, este es un proceso ineficiente, ya que la recombinación homóloga representa solo entre el 10 −2 y el 10 −3 de las integraciones de ADN. [5] [6] A menudo, el marcador de selección de fármacos en el constructo se utiliza para seleccionar células en las que se ha producido el evento de recombinación.
Estas células madre que carecen del gen podrían utilizarse in vivo , por ejemplo en ratones, insertándolas en embriones tempranos. Si el ratón quimérico resultante contiene el cambio genético en su línea germinal, éste podría transmitirse a la descendencia. [5]
En los organismos diploides , que contienen dos alelos para la mayoría de los genes y también pueden contener varios genes relacionados que colaboran en la misma función, se realizan rondas adicionales de transformación y selección hasta que se eliminan todos los genes seleccionados. Puede ser necesaria la cría selectiva para producir animales homocigotos knockout.
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Actualmente, se utilizan tres métodos que implican la selección precisa de una secuencia de ADN para introducir una rotura de doble cadena. Una vez que esto ocurre, los mecanismos de reparación de la célula intentarán reparar esta rotura de doble cadena, a menudo mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ), que implica la unión directa de los dos extremos cortados. [6] Esto puede hacerse de forma imperfecta, por lo que a veces provoca inserciones o deleciones de pares de bases, que causan mutaciones por desplazamiento del marco de lectura . Estas mutaciones pueden hacer que el gen en el que se producen deje de ser funcional, creando así un knockout de ese gen. Este proceso es más eficiente que la recombinación homóloga y, por lo tanto, se puede utilizar más fácilmente para crear knockouts bialélicos. [6]
Las nucleasas de dedo de zinc consisten en dominios de unión al ADN que pueden dirigirse con precisión a una secuencia de ADN. [6] Cada dedo de zinc puede reconocer codones de una secuencia de ADN deseada y, por lo tanto, se puede ensamblar modularmente para unirse a una secuencia particular. [8] Estos dominios de unión están acoplados con una endonucleasa de restricción que puede causar una rotura de doble cadena (DSB) en el ADN. [6] Los procesos de reparación pueden introducir mutaciones que destruyan la funcionalidad del gen. [ cita requerida ]
Las nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción ( TALEN ) también contienen un dominio de unión al ADN y una nucleasa que puede escindir el ADN. [9] La región de unión al ADN consta de repeticiones de aminoácidos que reconocen cada una un solo par de bases de la secuencia de ADN deseada. [8] Si esta escisión se dirige a una región codificante de genes, y la reparación mediada por NHEJ introduce inserciones y deleciones, a menudo se produce una mutación por cambio de marco, lo que altera la función del gen. [9]
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) es una técnica de ingeniería genética que permite la edición precisa del genoma. Una aplicación de CRISPR es la inactivación de genes, que implica desactivar o "eliminar" un gen específico en un organismo. [ cita requerida ]
El proceso de eliminación de genes con CRISPR implica tres pasos principales: diseñar un ARN guía (ARNg) que se dirija a una ubicación específica en el genoma, administrar el ARNg y una enzima Cas9 (que actúa como una tijera molecular) a la célula diana y luego permitir que la célula repare el corte en el ADN. Cuando la célula repara el corte, puede volver a unir los extremos cortados, lo que da como resultado un gen no funcional, o introducir una mutación que altera la función del gen.
Esta técnica se puede utilizar en una variedad de organismos, incluidas bacterias, levaduras, plantas y animales, y permite a los científicos estudiar la función de genes específicos observando los efectos de su ausencia. La eliminación de genes basada en CRISPR es una herramienta poderosa para comprender la base genética de las enfermedades y para desarrollar nuevas terapias.
Es importante señalar que la eliminación de genes basada en CRISPR, como cualquier técnica de ingeniería genética, tiene el potencial de producir efectos no deseados o dañinos en el organismo, por lo que debe usarse con precaución. [8] [10] El Cas9 acoplado causará una rotura de doble cadena en el ADN. [8] Siguiendo el mismo principio que los dedos de zinc y las TALEN, los intentos de reparar estas roturas de doble cadena a menudo resultan en mutaciones de cambio de marco que dan como resultado un gen no funcional. [8] La tecnología no invasiva CRISPR-Cas9 ha eliminado con éxito un gen asociado con la depresión y la ansiedad en ratones, siendo el primer método exitoso que atraviesa la barrera hematoencefálica para permitir la modificación genética. [11]
La inserción de un gen es similar a la eliminación de un gen, pero reemplaza un gen por otro en lugar de eliminarlo. [ cita requerida ]
Un knockout genético condicional permite la eliminación de genes en un tejido de una manera específica para el tejido. Esto es necesario en lugar de un knockout genético si la mutación nula llevaría a la muerte embrionaria , [12] o si un tejido o tipo de célula específico es de interés específico. Esto se hace introduciendo secuencias cortas llamadas sitios loxP alrededor del gen. Estas secuencias se introducirán en la línea germinal a través del mismo mecanismo que un knockout. Esta línea germinal puede luego cruzarse con otra línea germinal que contenga Cre-recombinasa , que es una enzima viral que puede reconocer estas secuencias, recombinarlas y eliminar el gen flanqueado por estos sitios. [ cita requerida ]
Los genes que no participan en el desarrollo temprano se han estudiado de manera eficaz mediante métodos de eliminación de genes. Sin embargo, normalmente no es posible eliminar genes que están activos durante el desarrollo temprano sin que el organismo sufra un desenlace fatal. Un método para evitarlo es la eliminación condicional. Utilizando una recombinasa específica del sitio llamada Cre, la técnica original de eliminación condicional recombinaba secuencias diana cortas conocidas como LoxP. Desde entonces, se han creado y empleado otras recombinasas en experimentos de eliminación condicional. [ cita requerida ]
Los knockouts se utilizan principalmente para comprender el papel de un gen específico o una región de ADN comparando el organismo knockout con un tipo salvaje con un trasfondo genético similar . [ cita requerida ]
Los organismos knockout también se utilizan como herramientas de detección en el desarrollo de fármacos , para identificar procesos biológicos específicos o deficiencias mediante el uso de un knockout específico, o para comprender el mecanismo de acción de un fármaco mediante el uso de una biblioteca de organismos knockout que abarca todo el genoma , como en Saccharomyces cerevisiae . [13]