La tipificación de secuencias multilocus ( MLST ) es una técnica de biología molecular para la tipificación de múltiples loci , utilizando secuencias de ADN de fragmentos internos de múltiples genes de mantenimiento para caracterizar aislamientos de especies microbianas.
El primer esquema MLST que se desarrolló fue para Neisseria meningitidis , [1] el agente causal de la meningitis meningocócica y la septicemia . Desde su introducción para la investigación de la historia evolutiva, el MLST se ha utilizado no solo para patógenos humanos sino también para patógenos vegetales. [2]
La MLST mide directamente las variaciones de la secuencia de ADN en un conjunto de genes de mantenimiento y caracteriza las cepas por sus perfiles alélicos únicos. El principio de la MLST es simple: la técnica implica la amplificación por PCR seguida de la secuenciación del ADN . Las diferencias de nucleótidos entre cepas se pueden verificar en un número variable de genes según el grado de discriminación deseado.
El flujo de trabajo de MLST implica: 1) recopilación de datos, 2) análisis de datos y 3) análisis de secuencias de múltiples locus. En el paso de recopilación de datos, la identificación definitiva de la variación se obtiene mediante la determinación de la secuencia de nucleótidos de los fragmentos de genes. En el paso de análisis de datos, a todas las secuencias únicas se les asignan números de alelo y se combinan en un perfil alélico y se les asigna un tipo de secuencia (ST). Si se encuentran nuevos alelos y ST, se almacenan en la base de datos después de la verificación. En el paso de análisis final de MLST, la relación de los aislamientos se realiza comparando los perfiles alélicos. Los investigadores realizan estudios epidemiológicos y filogenéticos comparando los ST de diferentes complejos clonales. Se produce un gran conjunto de datos durante el proceso de secuenciación e identificación, por lo que se utilizan técnicas bioinformáticas para organizar, gestionar, analizar y fusionar todos los datos biológicos.
Para lograr el equilibrio entre el poder de identificación aceptable, el tiempo y el costo de la tipificación de la cepa, en los laboratorios se utilizan comúnmente entre siete y ocho genes de mantenimiento. Si tomamos como ejemplo a Staphylococcus aureus , en la tipificación MLST se utilizan siete genes de mantenimiento. Estos genes incluyen carbamato quinasa ( arcC ), shikimato deshidrogenasa ( aroE ), glicerol quinasa ( glpF ), guanilato quinasa ( gmk ), fosfato acetiltransferasa ( pta ), triosa fosfato isomerasa ( tpi ) y acetil coenzima A acetiltransferasa ( yqiL ), como se especifica en el sitio web de MLST. Sin embargo, no es raro que se utilicen hasta diez genes de mantenimiento. Para Vibrio vulnificus , los genes de mantenimiento utilizados son la glucosa-6-fosfato isomerasa ( glp ), la ADN girasa, subunidad B ( gyrB ), la malato-lactato deshidrogenasa ( mdh ), la metionil-ARNt sintetasa ( metG ), la fosforribosilaminoimidazol sintetasa ( purM ), la treonina deshidrogenasa ( dtdS ), la diaminopimelato descarboxilasa ( lysA ), la transhidrogenasa subunidad alfa ( pntA ), la dihidroorotasa ( pyrC ) y la triptofanasa ( tnaA ). Por lo tanto, tanto el número como el tipo de genes de mantenimiento interrogados por MLST pueden diferir de una especie a otra.
Para cada uno de estos genes de mantenimiento, las diferentes secuencias se asignan como alelos y los alelos en los loci proporcionan un perfil alélico. Una serie de perfiles puede entonces ser el marcador de identificación para la tipificación de cepas. Las secuencias que difieren incluso en un solo nucleótido se asignan como alelos diferentes y no se da ninguna ponderación para tener en cuenta el número de diferencias de nucleótidos entre alelos, ya que no podemos distinguir si las diferencias en múltiples sitios de nucleótidos son el resultado de múltiples mutaciones puntuales o un solo intercambio recombinacional. La gran cantidad de alelos potenciales en cada uno de los loci proporciona la capacidad de distinguir miles de millones de perfiles alélicos diferentes, y solo se esperaría que una cepa con el alelo más común en cada locus ocurriera por casualidad aproximadamente una vez en 10,000 aislamientos. [ cita requerida ] A pesar de que MLST proporciona un alto poder discriminatorio, la acumulación de cambios de nucleótidos en los genes de mantenimiento es un proceso relativamente lento y el perfil alélico de un aislamiento bacteriano es lo suficientemente estable en el tiempo para que el método sea ideal para la epidemiología global.
La relación de los aislamientos se muestra como un dendrograma construido utilizando la matriz de diferencias por pares entre sus perfiles alélicos, eBURST o un árbol de expansión mínima (MST). El dendrograma es solo una forma conveniente de mostrar aquellos aislamientos que tienen perfiles alélicos idénticos o muy similares que se puede suponer que se derivan de un ancestro común; las relaciones entre aislamientos que difieren en más de tres de siete loci probablemente no sean confiables y no deben tomarse para inferir su filogenia. [3] [4] El MST conecta todas las muestras de tal manera que la distancia sumada de todas las ramas del árbol es mínima. [5]
Alternativamente, la relación de los aislamientos también se puede analizar conAnálisis de secuencias de múltiples loci ( MLSA ). Este no utiliza los alelos asignados, sino que concatena las secuencias de los fragmentos de genes de los genes de mantenimiento y utiliza esta secuencia concatenada para determinar las relaciones filogenéticas. A diferencia del MLST, este análisis asigna una mayor similitud entre secuencias que difieren solo en un único nucleótido y una menor similitud entre secuencias con diferencias de múltiples nucleótidos. Como resultado, este análisis es más adecuado para organismos con una evolución clonal y menos adecuado para organismos en los que los eventos de recombinación ocurren muy a menudo. También se puede utilizar para determinar las relaciones filogenéticas entre especies estrechamente relacionadas. [6] Los términos MLST y MLSA se consideran muy a menudo intercambiables. Sin embargo, esto no es correcto ya que cada método de análisis tiene sus características y usos distintivos. Se debe tener cuidado de utilizar el término correcto.
Se habían establecido enfoques de tipificación serológica anteriores para diferenciar los aislamientos bacterianos, pero la tipificación inmunológica tiene desventajas, como la dependencia de unos pocos loci antigénicos y reactividades impredecibles de los anticuerpos con diferentes variantes antigénicas. Se han propuesto varios esquemas de tipificación molecular para determinar la relación de los patógenos, como la electroforesis en gel de campo pulsado ( PFGE ), la ribotipificación y la huella digital basada en PCR. Pero estos métodos de subtipificación basados en bandas de ADN no proporcionan análisis evolutivos significativos. A pesar de que muchos investigadores consideran la PFGE como el "estándar de oro", muchas cepas no son tipificables mediante esta técnica debido a la degradación del ADN durante el proceso (frotis de gel).
El método de MLST es distinto de la electroforesis enzimática de múltiples locus (MLEE), que se basa en diferentes movilidades electroforéticas (EM) de múltiples enzimas metabólicas centrales. Los alelos en cada locus definen la EM de sus productos, ya que las diferentes secuencias de aminoácidos entre enzimas dan como resultado diferentes movilidades y bandas distintas cuando se procesan en un gel. La relación de los aislamientos se puede visualizar con un dendrograma generado a partir de la matriz de diferencias por pares entre los tipos electroforéticos. Este método tiene una resolución menor que la MLST por varias razones, todas ellas derivadas del hecho de que la diversidad de fenotipos enzimáticos es simplemente un indicador de la diversidad de secuencias de ADN. En primer lugar, las enzimas pueden tener diferentes secuencias de aminoácidos sin tener EM suficientemente diferentes como para dar bandas distintas. En segundo lugar, las "mutaciones silenciosas" pueden alterar la secuencia de ADN de un gen sin alterar los aminoácidos codificados. En tercer lugar, el fenotipo de la enzima puede alterarse fácilmente en respuesta a las condiciones ambientales y afectar gravemente la reproducibilidad de los resultados de MLEE: las modificaciones comunes de las enzimas son la fosforilación, la unión de cofactores y la escisión de las secuencias de transporte. Esto también limita la comparabilidad de los datos de MLEE obtenidos por diferentes laboratorios, mientras que MLST proporciona datos de secuencias de ADN portátiles y comparables y tiene un gran potencial para la automatización y la estandarización.
El MLST no debe confundirse con el código de barras del ADN . Este último es un método taxonómico que utiliza marcadores genéticos cortos para reconocer especies particulares de eucariotas. Se basa en el hecho de que el ADN mitocondrial (ADNmt) o algunas partes del cistrón de ADN ribosómico tienen tasas de mutación relativamente rápidas, lo que da lugar a una variación significativa en las secuencias entre especies. Los métodos de ADNmt solo son posibles en eucariotas (ya que los procariotas carecen de mitocondrias), mientras que el MLST, aunque inicialmente desarrollado para procariotas, ahora está encontrando aplicación en eucariotas y, en principio, podría aplicarse a cualquier reino.
La MLST es muy inequívoca y portátil. Los materiales necesarios para la determinación de ST se pueden intercambiar entre laboratorios. Se puede acceder electrónicamente a las secuencias de cebadores y a los protocolos. Es reproducible y escalable. La MLST es automática y combina los avances en la secuenciación de alto rendimiento y la bioinformática con técnicas establecidas de genética de poblaciones. Los datos de la MLST se pueden utilizar para investigar las relaciones evolutivas entre las bacterias. La MLST proporciona un buen poder discriminatorio para diferenciar los aislamientos.
La aplicación de MLST es enorme y constituye un recurso para las comunidades científica, de salud pública y veterinaria, así como para la industria alimentaria. A continuación se presentan ejemplos de aplicaciones de MLST.
Campylobacter es el agente causal más común de enfermedades infecciosas intestinales bacterianas, que suelen surgir de aves de corral poco cocidas o leche no pasteurizada. Sin embargo, su epidemiología es poco conocida, ya que rara vez se detectan brotes, por lo que las fuentes y las vías de transmisión de los brotes no se pueden rastrear fácilmente. Además, los genomas de Campylobacter son genéticamente diversos e inestables, con una recombinación intergenómica e intragenómica frecuente, junto con una variación de fase, lo que complica la interpretación de los datos de muchos métodos de tipificación. Hasta hace poco, con la aplicación de la técnica MLST, la tipificación de Campylobacter ha logrado un gran éxito y se ha añadido a la base de datos MLST. Al 1 de mayo de 2008, la base de datos MLST de Campylobacter contiene 3516 aislamientos y alrededor de 30 publicaciones que utilizan o mencionan MLST en la investigación sobre Campylobacter (http://pubmlst.org/campylobacter/).
La MLST ha proporcionado una imagen más rica y texturizada de las bacterias dentro de las poblaciones humanas y de las variantes de cepas que pueden ser patógenas para los humanos, las plantas y los animales. La técnica MLST fue utilizada por primera vez por Maiden et al. (1) para caracterizar Neisseria meningitidis utilizando seis loci. La aplicación de MLST ha resuelto claramente los principales linajes meningocócicos que se sabe que son responsables de la enfermedad invasiva en todo el mundo. Para mejorar el nivel de poder discriminatorio entre los principales linajes invasivos, ahora se están utilizando siete loci y muchos laboratorios los han aceptado como el método de elección para caracterizar los aislamientos meningocócicos. Es un hecho bien conocido [7] que los intercambios recombinacionales ocurren comúnmente en N. meningitidis , lo que lleva a una rápida diversificación de los clones meningocócicos. MLST ha proporcionado con éxito un método confiable para la caracterización de clones dentro de otras especies bacterianas en las que las tasas de diversificación clonal son generalmente más bajas.
S. aureus causa varias enfermedades. El S. aureus resistente a la meticilina ( MRSA ) ha generado una creciente preocupación por su resistencia a casi todos los antibióticos, excepto la vancomicina. Sin embargo, la mayoría de las infecciones graves por S. aureus en la comunidad, y muchas en los hospitales, son causadas por cepas sensibles a la meticilina (MSSA) y ha habido pocos intentos de identificar los clones hipervirulentos de MSSA asociados con enfermedades graves. Por lo tanto, MLST se desarrolló para proporcionar un método inequívoco para caracterizar los clones de MRSA y para la identificación de los clones de MSSA asociados con enfermedades graves.
S. pyogenes causa enfermedades que van desde faringitis hasta impétigo potencialmente mortal, incluida la fascitis necrosante.Se ha desarrollado un esquema MLST para S. pyogenes . En la actualidad, la base de datos (mlst.net) [8] contiene los perfiles alélicos de los aislamientos que representan la diversidad mundial del organismo y los aislamientos de enfermedades invasivas graves. [9]
C. albicans es un hongo patógeno de los humanos y es responsable de infecciones del torrente sanguíneo adquiridas en el hospital. La técnica MLST se ha utilizado para caracterizar los aislamientos de C. albicans . La combinación de los alelos en los diferentes loci da como resultado tipos de secuencias diploides únicas que se pueden utilizar para discriminar cepas. Se ha demostrado que la MLST se aplica con éxito para estudiar la epidemiología de C. albicans en el hospital, así como la diversidad de aislamientos de C. albicans obtenidos de diversos nichos ecológicos, incluidos huéspedes humanos y animales.
El género Cronobacter está compuesto por 7 especies. Antes de 2007, se aplicaba a estos organismos el nombre de especie única Enterobacter sakazakii . El esquema MLST de Cronobacter se aplicó inicialmente para distinguir entre C. sakazakii y C. malonaticus porque la secuenciación del 16S rDNA no siempre es lo suficientemente precisa y la biotipificación es demasiado subjetiva. [10] El esquema MLST de Cronobacter utiliza 7 alelos; atpD , fusA , glnS , gltB , gyrB , infB y ppsA dando una secuencia concatenada de 3036 pb para el análisis filogenético (MLSA) y la genómica comparativa . [11] El MLST también se ha utilizado en el reconocimiento formal de nuevas especies de Cronobacter . [12] El método ha revelado una fuerte asociación entre un linaje genético, el tipo de secuencia 4 (ST4), y los casos de meningitis neonatal. [13] El sitio MLST de Cronobacter está en http://www.pubMLST.org/cronobacter.
La MLST parece ser la mejor opción para los estudios genéticos de poblaciones, pero es costosa. Debido a la conservación de la secuencia en los genes de mantenimiento, la MLST a veces carece del poder discriminatorio para diferenciar cepas bacterianas, lo que limita su uso en investigaciones epidemiológicas. Para mejorar el poder discriminatorio de la MLST, se ha desarrollado un enfoque de tipificación de secuencias de locus de virulencia múltiple (MVLST) utilizando Listeria monocytogenes . [14] La MVLST amplía los beneficios de la MLST, pero se dirige a los genes de virulencia, que pueden ser más polimórficos que los genes de mantenimiento. La genética de poblaciones no es el único factor relevante en una epidemia. Los factores de virulencia también son importantes para causar enfermedades, y los estudios genéticos de poblaciones tienen dificultades para monitorearlos. Esto se debe a que los genes involucrados a menudo son altamente recombinantes y móviles entre cepas en comparación con el marco genético de la población. Así, por ejemplo, en Escherichia coli , identificar cepas que portan genes de toxinas es más importante que tener una evaluación basada en la genética de poblaciones de las cepas prevalentes.
La llegada de las tecnologías de secuenciación de segunda generación ha hecho posible obtener información de secuencias de todo el genoma bacteriano a un costo y esfuerzo relativamente modestos, y ahora se puede asignar MLST a partir de la información de la secuencia de todo el genoma, en lugar de secuenciar cada locus por separado, como se hacía cuando se desarrolló por primera vez MLST. [15] La secuenciación de todo el genoma proporciona información más rica para diferenciar cepas bacterianas (MLST utiliza aproximadamente el 0,1% de la secuencia genómica para asignar el tipo, mientras que ignora el resto del genoma bacteriano). Por ejemplo, la secuenciación de todo el genoma de numerosos aislamientos ha revelado que el linaje MLST único ST258 de Klebsiella pneumoniae comprende dos clados genéticos distintos, [16] proporcionando información adicional sobre la evolución y propagación de estos organismos resistentes a múltiples fármacos, y refutando la hipótesis anterior de un origen clonal único para ST258. [17]
Las bases de datos MLST contienen las secuencias de alelos de referencia y los tipos de secuencias para cada organismo, y también aíslan datos epidemiológicos. Los sitios web contienen software de interrogación y análisis que permite a los usuarios consultar sus secuencias de alelos y tipos de secuencias. MLST se utiliza ampliamente como herramienta para investigadores y trabajadores de la salud pública.
La mayoría de las bases de datos MLST están alojadas en un servidor web ubicado actualmente en la Universidad de Oxford (pubmlst.org).
La base de datos alojada en el sitio contiene las secuencias de alelos de referencia específicos del organismo y listas de ST para organismos individuales.
Para facilitar la recopilación y el formato de las secuencias utilizadas, se ha desarrollado un complemento sencillo y gratuito para Firefox (enlace archivado el 22 de febrero de 2014 en Wayback Machine ).
{{cite journal}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link){{cite journal}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link){{cite journal}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link){{cite journal}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link){{cite journal}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link)