La β-galactosidasa (EC 3.2.1.23, beta-gal o β-gal ; nombre sistemático β- D -galactosido galactohidrolasa ) es una enzima glicósido hidrolasa que cataliza la hidrólisis de residuos terminales no reductores de β- D -galactosa en β- D -galactósidos. (Esta enzima digiere muchos β-galactosidos, no solo la lactosa. A veces se la denomina vagamente lactasa , pero ese nombre generalmente se reserva para las enzimas digestivas de los mamíferos que descomponen específicamente la lactosa).
Los β-galactosidos incluyen carbohidratos que contienen galactosa , donde el enlace glucosídico se encuentra por encima de la molécula de galactosa. Los sustratos de diferentes β-galactosidasas incluyen el gangliósido GM1, las lactosilceramidas, la lactosa y varias glucoproteínas . [1]
La β-galactosidasa es una exoglucosidasa que hidroliza el enlace β-glicosídico formado entre una galactosa y su fracción orgánica. También puede escindir fucósidos y arabinósidos , pero a una velocidad mucho menor. Es una enzima esencial en el cuerpo humano. Las deficiencias en la proteína pueden provocar galactosialidosis o síndrome de Morquio B. En E. coli , el gen lacZ es el gen estructural de la β-galactosidasa; que está presente como parte del sistema inducible lac operón que se activa en presencia de lactosa cuando el nivel de glucosa es bajo. La síntesis de β-galactosidasa se detiene cuando los niveles de glucosa son suficientes. [2]
La β-galactosidasa tiene muchos homólogos basados en secuencias similares. Algunos de ellos son la β-galactosidasa evolucionada (EBG), la β-glucosidasa , la 6-fosfo-β-galactosidasa, la β-manosidasa y la lactasa-florizina hidrolasa. Aunque pueden ser estructuralmente similares, todas tienen funciones diferentes. [3] La beta-gal es inhibida por la L -ribosa y por inhibidores competitivos como el 2-feniletil 1-tio-β- D -galactopiranósido (PETG), la D -galactonolactona, el isopropil tio-β- D -galactósido (IPTG) y la galactosa. [4]
La β-galactosidasa es importante para los organismos, ya que es un proveedor clave en la producción de energía y una fuente de carbonos a través de la descomposición de la lactosa en galactosa y glucosa. También es importante para las personas intolerantes a la lactosa , ya que es responsable de producir leche y otros productos lácteos sin lactosa. Muchos humanos adultos carecen de la enzima lactasa , que tiene la misma función que la β-galactosidasa, por lo que no pueden digerir adecuadamente los productos lácteos. La β-galactosida se utiliza en productos lácteos como el yogur, la crema agria y algunos quesos que se tratan con la enzima para descomponer la lactosa antes del consumo humano. En los últimos años, la β-galactosidasa se ha investigado como un posible tratamiento para la intolerancia a la lactosa a través de una terapia de reemplazo genético en la que podría colocarse en el ADN humano para que las personas puedan descomponer la lactosa por sí mismas. [5] [6]
Los 1.023 aminoácidos de la β-galactosidasa de E. coli fueron secuenciados en 1983, [7] y su estructura se determinó once años después en 1994. La proteína es un homotetrámero de 464 kDa con simetría de 2,2,2 puntos . [8] Cada unidad de β-galactosidasa consta de cinco dominios ; el dominio 1 es un barril β de tipo jelly-roll , los dominios 2 y 4 son barriles similares a la fibronectina tipo III , el dominio 5 un nuevo sándwich β, mientras que el dominio central 3 es un barril distorsionado de tipo TIM , que carece de la quinta hélice con una distorsión en la sexta cadena. [8]
El tercer dominio contiene el sitio activo. [9] El sitio activo está formado por elementos de dos subunidades del tetrámero, y la disociación del tetrámero en dímeros elimina elementos críticos del sitio activo. La secuencia amino-terminal de la β-galactosidasa, el péptido α involucrado en la α-complementación, participa en una interfaz de subunidades. Sus residuos 22-31 ayudan a estabilizar un haz de cuatro hélices que forma la parte principal de esa interfaz, y los residuos 13 y 15 también contribuyen a la interfaz activadora. [ cita requerida ] Estas características estructurales proporcionan una justificación para el fenómeno de la α-complementación, donde la eliminación del segmento amino-terminal da como resultado la formación de un dímero inactivo.
La β-galactosidasa puede catalizar tres reacciones diferentes en los organismos. En una, puede pasar por un proceso llamado transgalactosilación para producir alolactosa , creando un ciclo de retroalimentación positiva para la producción de β-galactosa. La alolactosa también puede escindirse para formar monosacáridos. También puede hidrolizar la lactosa en galactosa y glucosa que procederán a la glucólisis . [3] El sitio activo de la β-galactosidasa cataliza la hidrólisis de su sustrato disacárido a través de la unión "superficial" (sitio no productivo) y "profunda" (sitio productivo). Los galactósidos como PETG e IPTG se unirán en el sitio superficial cuando la enzima esté en conformación "abierta", mientras que los análogos del estado de transición como L -ribosa y D -galactonolactona se unirán en el sitio profundo cuando la conformación esté "cerrada". [4]
La reacción enzimática consta de dos pasos químicos, galactosilación y desgalactosilación. La galactosilación es el primer paso químico de la reacción en el que Glu461 dona un protón a un oxígeno glucosídico, lo que da como resultado la unión covalente de la galactosa con Glu537. En el segundo paso, la desgalactosilación, el enlace covalente se rompe cuando Glu461 acepta un protón, reemplazando la galactosa por agua. Ocurren dos estados de transición en el sitio profundo de la enzima durante la reacción, uno después de cada paso. Cuando el agua participa en la reacción, se forma galactosa; de lo contrario, cuando la D -glucosa actúa como aceptor en el segundo paso, se produce la transgalactosilación. [4] Se ha medido cinéticamente que los tetrámeros individuales de la proteína catalizan reacciones a una velocidad de 38.500 ± 900 reacciones por minuto. [10] Los iones de potasio monovalentes (K + ) así como los iones de magnesio divalentes (Mg 2+ ) son necesarios para la actividad óptima de la enzima. El enlace β del sustrato es escindido por un grupo carboxilo terminal en la cadena lateral de un ácido glutámico .
En E. coli , se pensaba que Glu-461 era el nucleófilo en la reacción de sustitución . [11] Sin embargo, ahora se sabe que Glu-461 es un catalizador ácido . En cambio, Glu-537 es el nucleófilo real, [12] uniéndose a un intermediario galactosilo. En humanos , el nucleófilo de la reacción de hidrólisis es Glu-268. [13] Gly794 es importante para la actividad de la β-galactosidasa. Es responsable de poner la enzima en una conformación "cerrada", ligada al ligando, o conformación "abierta", actuando como una "bisagra" para el bucle del sitio activo. Las diferentes conformaciones aseguran que solo se produzca una unión preferencial en el sitio activo. En presencia de un sustrato lento, la actividad de Gly794 aumentó, así como un aumento en la galactosilación y una disminución en la desgalactosilación. [4]
El ensayo de β-galactosidasa se utiliza con frecuencia en genética , biología molecular y otras ciencias de la vida . [14] Se puede detectar una enzima activa utilizando un sustrato cromogénico artificial, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β- D -galactopiranósido, X-gal . La β-galactosidasa escindirá el enlace glucosídico en X-gal y formará galactosa y 5-bromo-4-cloro-3-hidroxiindol que se dimeriza y oxida a 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-índigo, un producto azul intenso que es fácil de identificar y cuantificar. [15] Se utiliza, por ejemplo, en la pantalla azul blanca . [16] Su producción puede ser inducida por un análogo no hidrolizable de la alolactosa , IPTG , que se une y libera el represor lac del operador lac, permitiendo así que se inicie la transcripción.
Se utiliza comúnmente en biología molecular como marcador reportero para monitorear la expresión génica. También exhibe un fenómeno llamado α-complementación que forma la base para el cribado azul/blanco de clones recombinantes. Esta enzima se puede dividir en dos péptidos, LacZ α y LacZ Ω , ninguno de los cuales es activo por sí mismo pero cuando ambos están presentes juntos, se reensamblan espontáneamente en una enzima funcional. Esta propiedad se explota en muchos vectores de clonación donde la presencia del gen lacZα en un plásmido puede complementar en trans otro gen mutante que codifica el LacZΩ en cepas de laboratorio específicas de E. coli . Sin embargo, cuando se insertan fragmentos de ADN en el vector, la producción de LacZα se interrumpe, por lo que las células no muestran actividad de β-galactosidasa. La presencia o ausencia de una β-galactosidasa activa puede detectarse mediante X-gal , que produce un colorante azul característico cuando es escindido por la β-galactosidasa, lo que proporciona un medio fácil de distinguir la presencia o ausencia de producto clonado en un plásmido. En estudios de translocaciones cromosómicas de leucemia, Dobson y colegas utilizaron una proteína de fusión de LacZ en ratones, [17] explotando la tendencia de la β-galactosidasa a oligomerizarse para sugerir un papel potencial para la oligomericidad en la función de la proteína de fusión MLL. [18]
Un estudio reciente realizado en 2020-2021 determinó que la actividad de la beta-galactosidasa se correlaciona con la senescencia de las células. La senescencia de las células se puede interpretar como células que no se dividen, pero que no mueren. La actividad de la beta-galactosidasa puede sobreexpresarse, lo que puede provocar diversas enfermedades que afectan a una amplia gama de sistemas corporales. Estos sistemas incluyen el sistema cardiovascular, el sistema esquelético y muchos más. La detección de células senescentes se puede lograr midiendo la actividad de la beta-galactosidasa lisosomal. [19]
Una nueva isoforma para beta-galactosidasa con actividad óptima a pH 6.0 (beta-gal asociada a la senescencia o SA-beta-gal ) [20] que se expresa específicamente en la senescencia (la detención irreversible del crecimiento de las células). Incluso se desarrollaron ensayos cuantitativos específicos para su detección. [21] [15] [22] Sin embargo, ahora se sabe que esto se debe a una sobreexpresión y acumulación de la beta-galactosidasa endógena lisosomal, [23] y su expresión no es necesaria para la senescencia. No obstante, sigue siendo el biomarcador más utilizado para las células senescentes y envejecidas, porque es confiable y fácil de detectar.
Algunas especies de bacterias, incluida E. coli , tienen genes de β-galactosidasa adicionales. Un segundo gen, llamado gen de β-galactosidasa evolucionada ( ebgA ) se descubrió cuando cepas con el gen lacZ eliminado (pero que aún contenían el gen para la permeasa de galactósido, lacY ), se sembraron en un medio que contenía lactosa (u otros 3-galactósidos) como única fuente de carbono. Después de un tiempo, ciertas colonias comenzaron a crecer. Sin embargo, la proteína EbgA es una lactasa ineficaz y no permite el crecimiento en lactosa. Dos clases de mutaciones puntuales únicas mejoran drásticamente la actividad de la enzima ebg hacia la lactosa. [24] [25] y, como resultado, la enzima mutante puede reemplazar a la β-galactosidasa lacZ. [26] EbgA y LacZ son 50% idénticos a nivel de ADN y 33% idénticos a nivel de aminoácidos. [27] La enzima ebg activa es un agregado de productos del gen ebgA y del gen ebgC en una proporción de 1:1, siendo la forma activa de las enzimas ebg un heterooctámero α 4 β4. [28]
Gran parte del trabajo realizado sobre la β-galactosidasa se deriva de E. coli. Sin embargo, la enzima se puede encontrar en muchas plantas (especialmente frutas), mamíferos, levaduras, bacterias y hongos. [29] Los genes de la β-galactosidasa pueden diferir en la longitud de su secuencia codificante y la longitud de las proteínas formadas por aminoácidos. [30] Esto separa las β-galactosidasas en cuatro familias: GHF-1, GHF-2, GHF-35 y GHF-42. [31] E. Coli pertenece a GHF-2, todas las plantas pertenecen a GHF-35 y Thermus thermophilus pertenece a GHF-42. [31] [30] Varias frutas pueden expresar múltiples genes de β-galactosidasa. Hay al menos siete genes de β-galactosidasa expresados en el desarrollo del fruto del tomate, que tienen una similitud de aminoácidos entre el 33% y el 79%. [32] Un estudio cuyo objetivo era identificar el ablandamiento de la fruta de los duraznos encontró 17 expresiones genéticas diferentes de β-galactosidasas. [30] La única otra estructura cristalina conocida de β-galactosidasa es la de Thermus thermophilus . [31]
