Ha colaborado frecuentemente con los cineastas Paul Schrader, Abel Ferrara, Lars von Trier, Julian Schnabel, Wes Anderson y Robert Eggers.

[1]​ Los primeros papeles de Dafoe incluyen The Loveless (1982), Streets of Fire (1984) y To Live and Die in LA (1985).

También interpretó a Nuidis Vulko en la película Aquaman (2018) de DC Extended Universe y Zack Snyder's Justice League (2021).

Estudió arte dramático en la Universidad de Wisconsin–Milwaukee; luego formó parte del grupo avant-garde llamado Theatre X. Dafoe conoció a la directora Elizabeth LeCompte en el Performance Group.

En 1988, Dafoe protagonizó otra película ambientada durante la Guerra de Vietnam, esta vez como el agente Buck McGriff en Off Limits.

El director y el guionista pensaban que Dafoe se parecía físicamente al Joker, pero el rol finalmente fue para Jack Nicholson.

Interpretó un excéntrico agente del FBI en The Boondock Saints (1999), y a un investigador privado en American Psycho (2000).

En 2006 interpretó al detective del NYPD Stan Aubray que sigue los rastros de un asesino serial en el thriller Anamorph, junto a Scott Speedman y Peter Stormare.

Para el crítico Tomás Obregón, «Willem Dafoe pasará a la historia por el trasfondo perverso y su maquiavélica sonrisa de demonio que imprime en sus personajes del lado oscuro y por haber protagonizado la película más controvertida de la historia».

[11]​ En 2024 trabaja por tercera vez con el cineasta Robert Eggers, al interpretar al Profesor Albin Eberhart Von Franz, un controvertido científico, experto en lo oculto y el misticismo, en la película Nosferatu (2024), junto con Nicholas Hoult, Lily-Rose Depp, Aaron Taylor-Johnson, Emma Corrin y Bill Skarsgård.