Fue usado anteriormente para el tratamiento de infecciones causadas por bacterias gram positivas productoras de betalactamasa como el Staphylococcus aureus, pero actualmente no es usado clínicamente.

Su papel como antibiótico ha sido ampliamente reemplazado por la flucloxacilina y dicloxacilina, sin embargo el término «Staphylococcus aureus meticilino resistente» (EAMR o SARM) continúa siendo usado para describir cepas de Staphylococcus aureus resistentes a penicilina.

Como los otros antibióticos betalactámicos la meticilina actúa inhibiendo la síntesis de la pared celular bacteriana.

Actúa mediante la unión e inhibición competitiva de la enzima transpeptidasa usada por la bacteria para generar los enlaces cruzados (D-alanil-alanina) usados en la síntesis del peptidoglicano.

La meticilina y otros antibíoticos betalactámicos son análogos estructurales de la D-alanil-alanina, y las enzimas transpeptidasas que se unen a ella, son llamadas «proteínas de unión a la penicilina» (PUP).