Durante 1529 tuvieron lugar las negociaciones para acordar su casamiento con Francisco de Borja.
El emperador Carlos I de España, representado por su mayordomo Pedro González de Mendoza, negociaba en nombre de doña Leonor, instando al duque de Gandía a que aceptase sus condiciones.
Tras pactar el matrimonio, los esposos se reunieron en Toledo en agosto de 1529.
Su enlace con Francisco de Borja tuvo lugar en 1529 en el Alcázar Real.
Tuvieron amplia descendencia, ocho hijos, de los cuales cinco fueron varones y tres mujeres: Carlos en 1530, Isabel en 1532, Juan en 1533, Álvaro en 1535, Juana Francisca en 1535, Fernando en 1537, Dorotea en 1538 y Alonso en 1539.