Su abuelo había figurado entre los primeros pobladores del "Holy Experiment" de William Penn.

Su padre y su nueva esposa se trasladaron a Carolina del Norte y Bartram permaneció en la granja de sus tíos, siendo criado por su abuela.

No tuvo una escolarización formal, pero poseía una mente lúcida y abierta además de un gran interés en las plantas.

John Bartram hizo viajes por los montes Alleghenies y los Catskills, así como por los estados de Carolina del Norte, Carolina del Sur y Florida en busca de nuevas plantas.

En 1765 Jorge III lo nombró "Botánico Real", un puesto que conservaría hasta su muerte.