Florey realizó sus estudios en la Universidad de Adelaida y se trasladó a Oxford para especializarse.

Colaboró con Ernst Boris Chain para extraer la penicilina de los cultivos del hongo Penicillium notatum y purificarla mediante métodos químicos, objetivo que ambos investigadores lograron en 1940.

En 1938, trabajando con Ernst Boris Chain, Norman Heatley y Edward Abraham, leyó el artículo de Alexander Fleming que analizaba los efectos antibacterianos del Penicillium notatum.

[1]​ Su cara, ojos y cuero cabelludo estaban hinchados, hasta el punto de que le habían extirpado un ojo para aliviarle parte del dolor.

Sin embargo, Florey siempre dijo que el proyecto fue impulsado originalmente por intereses científicos, y que el descubrimiento medicinal fue una ventaja añadida: Florey compartió el Premio Nobel de Medicina en 1945 con Ernst Boris Chain y con Alexander Fleming.