Gilberto Agustoni asistió a la escuela primaria, la secundaria y el seminario en Lugano.

Después de sus estudios en Roma y Friburgo se doctoró en teología en 1947.

En 1950 fue llamado a Roma como secretario personal del cardenal Alfredo Ottaviani, función que cumplía al momento de la Intervención de Ottaviani en 1969.

Asumió como prefecto el 29 de noviembre de 1994, días después de que el papa Juan Pablo II le nombrara cardenal diácono de Santos Urbano y Lorenzo en Prima Porta en Prima Porta, el 26 de noviembre.

Estuvo a la cabeza de la Signatura Apostólica hasta el año 1998.