Los problemas para el franciscano llegaron con la guerra del Mixtón, una sublevación indígena encabezada por Coaxicar ante los abusos de algunos conquistadores españoles, quienes dieron al traste con el proceso de evangelización al tratar de eliminar toda la cultura prehispánica, a lo que los nativos se opusieron con violencia.
Tras ser martirizado, el religioso permaneció a la intemperie durante cinco días.
Según cuenta la leyenda, su cuerpo, que exhalaba olor a flores, fue hallado incorrupto el 10 de junio y trasladado al convento de Etzatlán.
A partir de ese momento, el lugar en el que se encontró su cadáver se convirtió, gracias al fervor de quienes le conocieron, en una especie de santuario alrededor del cual se formó, años después, una ciudad a la que bautizaron como San Juanito de Escobedo en su honor.
Al martirio de Fray Juan Calero siguió el de otros tres franciscanos que, como él, cayeron a manos de los nobles indígenas insurgentes: fray Antonio de Cuéllar, fray Francisco Lorenzo y fray Juan Francisco.