Ana entonces llegó a una situación donde representaba un importante papel político, y cuando en 1574 el rey Enrique de Valois (que había sido escogido para seguir en el trono polaco) abandonó el reino para ocupar el trono francés, Ana surgió como adversaria de Maximiliano II de Habsburgo, rey de Hungría y emperador del Sacro Imperio Romano Germánico.
Maximiliano II deseaba apoderarse del trono polaco y era otro de los candidatos para ser rey.
Sin embargo, en 1576, la alta nobleza polaca, viendo con malos ojos al Habsburgo, decidió escoger al conde húngaro Esteban Báthory como rey polaco, quien era príncipe de Transilvania.
El matrimonio se llevó a cabo el 1 de mayo de 1576 en Cracovia, aunque la alta nobleza permitió posteriormente que el matrimonio viviese en residencias separadas, puesto que Ana ya rondaba los 53 años, siendo cerca de 10 años mayor que su esposo.
Esteban Báthory murió el 12 de diciembre de 1586, y puesto que no tuvo hijos varones, entonces Ana heredó el trono polaco a los 63 años.