Los vectores virales son herramientas comúnmente utilizadas por los biólogos moleculares para introducir material genético en las células . Este proceso puede realizarse dentro de un organismo vivo ( in vivo ) o en cultivo celular ( in vitro ). Los virus han desarrollado mecanismos moleculares especializados para transportar eficientemente sus genomas dentro de las células que infectan. La entrega de genes u otro material genético mediante un vector se denomina transducción y las células infectadas se describen como transducidas. Los biólogos moleculares aprovecharon esta maquinaria por primera vez en la década de 1970. Paul Berg utilizó un virus SV40 modificado que contenía ADN del bacteriófago λ para infectar células de riñón de mono mantenidas en cultivo. [1]
Además de su uso en la investigación de biología molecular, los vectores virales se utilizan para la terapia génica y el desarrollo de vacunas . Los vectores pueden integrarse en el genoma de una célula o expresar transitoriamente un gen con vectores no integrativos . [2] : 50
Los vectores virales se adaptan a sus aplicaciones específicas, pero generalmente comparten algunas propiedades clave. [ cita necesaria ]
Los vectores virales se desarrollaron originalmente como una alternativa a la transfección de ADN desnudo para experimentos de genética molecular . En comparación con los métodos tradicionales de transfección (como la precipitación con fosfato cálcico ), la transducción puede garantizar que casi el 100% de las células estén infectadas sin afectar gravemente la viabilidad celular. [ cita necesaria ] Además, algunos virus se integran en el genoma celular facilitando una expresión estable. [ cita necesaria ]
Los genes codificantes de proteínas se pueden expresar utilizando vectores virales, comúnmente para estudiar la función de una proteína en particular. Los vectores virales, especialmente los retrovirus, que expresan de manera estable genes marcadores como GFP , se usan ampliamente para marcar permanentemente las células y rastrearlas a ellas y a su progenie, por ejemplo en experimentos de xenotrasplantes , cuando células infectadas in vitro se implantan en un animal huésped. [ cita necesaria ]
La inserción de genes , que se puede realizar con vectores virales, es más económica que la eliminación de genes . Pero como el silenciamiento de genes , un efecto que puede estar previsto con la inserción de genes, a veces no es específico y tiene efectos no deseados en otros genes, proporciona resultados menos confiables. Los vectores animales huéspedes también desempeñan un papel importante [ se necesita aclaración ] .
La terapia génica es una técnica para corregir genes defectuosos responsables del desarrollo de enfermedades. En el futuro, la terapia génica puede ofrecer una forma de curar enfermedades genéticas , como la inmunodeficiencia combinada grave , la fibrosis quística o incluso la hemofilia A. Debido a que estas enfermedades son el resultado de mutaciones en la secuencia del ADN de genes específicos, los ensayos de terapia génica han utilizado virus para administrar copias no mutadas de estos genes a las células del cuerpo del paciente. Ha habido una gran cantidad de éxitos de laboratorio con la terapia génica. Sin embargo, es necesario superar varios problemas de la terapia génica viral antes de que se generalice su uso. La respuesta inmune a los virus no sólo impide la entrega de genes a las células diana sino que también puede causar complicaciones graves para el paciente. En uno de los primeros ensayos de terapia génica en 1999, esto provocó la muerte de Jesse Gelsinger , que fue tratado con un vector adenoviral. [3]
Algunos vectores virales, por ejemplo los retrovirus gamma , insertan sus genomas en una ubicación aparentemente aleatoria en uno de los cromosomas del huésped , lo que puede alterar la función de los genes celulares y provocar cáncer. En un ensayo de terapia génica retroviral para inmunodeficiencia combinada grave realizado en 2002, cuatro de los pacientes desarrollaron leucemia como consecuencia del tratamiento; [4] tres de los pacientes se recuperaron después de la quimioterapia. [5] Los vectores basados en virus adenoasociados son mucho más seguros a este respecto, ya que siempre se integran en el mismo sitio del genoma humano, con aplicaciones en diversos trastornos, como la enfermedad de Alzheimer . [6]
Una vacuna de vector vivo es una vacuna que utiliza un organismo (normalmente virus o bacteria) que no causa enfermedad para transportar genes patógenos al cuerpo con el fin de estimular una respuesta inmunitaria . [7] Actualmente se están desarrollando virus que expresan proteínas patógenas como vacunas contra estos patógenos, basándose en el mismo razonamiento que las vacunas de ADN . Los genes utilizados en tales vacunas suelen ser proteínas de superficie que codifican antígenos del organismo patógeno . Luego se insertan en el genoma de un organismo no patógeno, donde se expresan en la superficie del organismo y pueden provocar una respuesta inmune. [ se necesita aclaración ]
A diferencia de las vacunas atenuadas , las vacunas de vectores virales carecen de otros genes patógenos necesarios para la replicación, por lo que la infección por el patógeno es imposible. Los adenovirus se están desarrollando activamente como vectores de vacunas.
Una cepa del virus canarypox modificada para transportar interleucina-2 felina se utiliza para tratar gatos con fibrosarcoma . [8]
Los retrovirus son uno de los pilares de los enfoques actuales de terapia génica. Los retrovirus recombinantes, como el virus de la leucemia murina de Moloney , tienen la capacidad de integrarse en el genoma del huésped de forma estable. Contienen una transcriptasa inversa para hacer una copia de ADN del genoma de ARN y una integrasa que permite la integración en el genoma del huésped . Se han utilizado en varios ensayos clínicos aprobados por la FDA, como el ensayo SCID-X1 . [9]
Los vectores retrovirales pueden ser capaces de replicarse o tener una replicación defectuosa. Los vectores con replicación defectuosa son la opción más común en los estudios porque a los virus se les han reemplazado o eliminado las regiones codificantes de los genes necesarios para rondas adicionales de replicación y empaquetado del virión con otros genes. Estos virus son capaces de infectar sus células diana y entregar su carga viral, pero luego no logran continuar la vía lítica típica que conduce a la lisis y muerte celular.
Por el contrario, los vectores virales con capacidad de replicación contienen todos los genes necesarios para la síntesis del virión y continúan propagándose una vez que se produce la infección. Debido a que el genoma viral de estos vectores es mucho más largo, la longitud del gen de interés insertado real es limitada en comparación con la posible longitud del inserto para vectores con replicación defectuosa. Dependiendo del vector viral, la longitud máxima típica de un inserto de ADN permitido en un vector viral con replicación defectuosa suele ser de aproximadamente 8 a 10 kB. [ se necesita verificación ] [10] Si bien esto limita la introducción de muchas secuencias genómicas, la mayoría de las secuencias de ADNc aún se pueden acomodar.
El principal inconveniente del uso de retrovirus como el retrovirus de Moloney implica el requisito de que las células se dividan activamente para la transducción . Como resultado, células como las neuronas son muy resistentes a la infección y la transducción por retrovirus.
Existe la preocupación de que la mutagénesis por inserción debida a la integración en el genoma del huésped pueda provocar cáncer o leucemia . Esta preocupación siguió siendo teórica hasta que la terapia génica para diez pacientes con SCID-X1 utilizando el virus de la leucemia murina de Moloney [11] dio como resultado dos casos de leucemia causada por la activación del oncogén LMO2 debido a la integración cercana del vector. [12]
Los lentivirus son una subclase de retrovirus. A veces se utilizan como vectores para terapia génica gracias a su capacidad de integrarse en el genoma de células que no se dividen, lo cual es una característica única de los lentivirus, ya que otros retrovirus solo pueden infectar células en división. El genoma viral en forma de ARN se transcribe de manera inversa cuando el virus ingresa a la célula para producir ADN , que luego se inserta en el genoma en una posición aleatoria (aunque hallazgos recientes sugieren que la inserción del ADN viral no es aleatoria sino que está dirigida a genes activos específicos y relacionados con la organización del genoma [13] ) por la enzima integrasa viral . El vector, ahora llamado provirus , permanece en el genoma y pasa a la descendencia de la célula cuando se divide. Hasta el momento no existen técnicas para determinar el lugar de integración, lo que puede plantear un problema. El provirus puede alterar la función de los genes celulares y provocar la activación de oncogenes que favorecen el desarrollo del cáncer , lo que suscita preocupaciones sobre posibles aplicaciones de los lentivirus en la terapia génica. Sin embargo, los estudios han demostrado que los vectores lentivirus tienen una menor tendencia a integrarse en lugares que potencialmente causan cáncer que los vectores gamma-retrovirales. [14] Más específicamente, un estudio encontró que los vectores lentivirales no causaron ni un aumento en la incidencia de tumores ni una aparición más temprana de tumores en una cepa de ratón propensa a sufrir tumores. [15] Además, los ensayos clínicos que utilizaron vectores lentivirales para administrar terapia génica para el tratamiento del VIH no experimentaron ningún aumento en los eventos mutagénicos u oncológicos. [16] Se han desarrollado versiones del vector lentiviral que no integran su material genético en el genoma de la célula, sino que sólo expresan genes de forma transitoria. [17] : 50
Por razones de seguridad, los vectores lentivirales nunca portan los genes necesarios para su replicación. Para producir un lentivirus, se transfectan varios plásmidos en la llamada línea celular empaquetadora , comúnmente HEK 293 . Uno o más plásmidos, generalmente denominados plásmidos empaquetadores, codifican las proteínas del virión , como la cápside y la transcriptasa inversa . Otro plásmido contiene el material genético que entregará el vector. Se transcribe para producir el genoma viral de ARN monocatenario y está marcado por la presencia de la secuencia ψ (psi). Esta secuencia se utiliza para empaquetar el genoma en el virión.
A diferencia de los lentivirus, el ADN adenoviral no se integra en el genoma y no se replica durante la división celular. [18] : 5 Esto limita su uso en la investigación básica, aunque los vectores adenovirales todavía se utilizan en experimentos in vitro y también in vivo . [19] Sus principales aplicaciones son la terapia génica y la vacunación . Dado que los seres humanos suelen entrar en contacto con adenovirus , que causan infecciones respiratorias, gastrointestinales y oculares, la mayoría de los pacientes ya han desarrollado anticuerpos neutralizantes que pueden inactivar el virus antes de que pueda llegar a la célula diana. Para superar este problema, los científicos están investigando actualmente adenovirus que infectan a diferentes especies contra las cuales los humanos no tienen inmunidad, por ejemplo, el adenovirus del chimpancé utilizado como vector para transportar el gen de pico del SARS-CoV-2 en la vacuna COVID de Oxford AstraZeneca. La pegilación de adenovirus para terapia génica puede ayudar a prevenir reacciones adversas debidas a la inmunidad preexistente a los adenovirus. [20]
El virus adenoasociado (AAV) es un virus pequeño que infecta a los humanos y algunas otras especies de primates. Actualmente no se sabe que el AAV cause enfermedades y provoca una respuesta inmunitaria muy leve. El AAV puede infectar células tanto en división como en no división y puede incorporar su genoma al de la célula huésped. Además, el AAV permanece en su mayor parte episomal (se replica sin incorporación al cromosoma); realizando una expresión larga y estable. [21] Estas características hacen del AAV un candidato muy atractivo para crear vectores virales para terapia génica. [1] Sin embargo, AAV sólo puede transportar hasta 5 kb, lo cual es considerablemente pequeño en comparación con la capacidad original de AAV. [21]
Se han diseñado vectores virales adenoasociados para evadir el reconocimiento del virus por parte de los receptores TLR9 incorporando genes inhibidores de TLR9 en el vector. [22]
Además, debido a su uso potencial como vector de terapia génica, los investigadores han creado un AAV alterado llamado virus adenoasociado autocomplementario (scAAV). Mientras que AAV empaqueta una sola hebra de ADN y requiere el proceso de síntesis de una segunda hebra, scAAV empaqueta ambas hebras que se hibridan para formar ADN bicatenario. Al omitir la síntesis de la segunda cadena, el scAAV permite una expresión rápida en la célula. [23] Por lo demás, scAAV tiene muchas características de su contraparte AAV.
Los virus vegetales se pueden utilizar para diseñar vectores virales, herramientas comúnmente utilizadas para introducir material genético en las células vegetales ; también son fuentes de biomateriales y dispositivos de nanotecnología. [24] [25] El virus del mosaico del tabaco (TMV) es el primer virus descubierto. Los vectores virales basados en el virus del mosaico del tabaco incluyen los de las tecnologías de expresión en plantas magnICON [26] y TRBO. [24]
Los vectores híbridos son virus vectoriales que están diseñados genéticamente para tener cualidades de más de un vector. Los virus se modifican para evitar las deficiencias de los vectores virales típicos, que pueden tener una capacidad de carga, inmunogenicidad y genotoxicidad limitadas y no lograr soportar una expresión transgénica adecuada a largo plazo . Mediante la sustitución de elementos indeseables por capacidades deseadas, los vectores híbridos pueden en el futuro superar a los vectores de transfección estándar en términos de seguridad y eficacia terapéutica. [27]
La elección de un vector viral para entregar material genético a las células conlleva algunos problemas logísticos. Hay un número limitado de vectores virales disponibles para uso terapéutico. Cualquiera de estos pocos vectores virales puede hacer que el cuerpo desarrolle una respuesta inmune si el vector se considera un invasor extraño. [28] [29] Una vez utilizado, el vector viral no puede volver a utilizarse eficazmente en el paciente porque será reconocido por el cuerpo. Si la vacuna o la terapia genética falla en los ensayos clínicos , el virus no se puede volver a utilizar en el paciente para una vacuna o terapia genética diferente en el futuro.
El paciente también podría tener inmunidad preexistente contra el vector viral, lo que haría que la terapia fuera ineficaz para ese paciente. [28] [30] Debido a que la preparación con una vacuna de ADN desnudo y el refuerzo con un vector viral da como resultado una respuesta inmune sólida a través de mecanismos aún indefinidos, a pesar de la inmunidad del vector viral preexistente, esta estrategia de vacunación puede contrarrestar este problema. [31] Sin embargo, este método puede presentar otro gasto y obstáculo en el proceso de distribución de la vacuna. La inmunidad preexistente también puede verse comprometida aumentando la dosis de la vacuna o cambiando la ruta de vacunación . [32]
Algunas deficiencias de los vectores virales (como la genotoxicidad y la baja expresión transgénica) pueden superarse mediante el uso de vectores híbridos .