El silenciamiento genético es la regulación de la expresión genética en una célula para prevenir la expresión de un determinado gen . [1] [2] El silenciamiento genético puede ocurrir durante la transcripción o la traducción y se utiliza a menudo en la investigación. [1] [2] En particular, los métodos utilizados para silenciar genes se utilizan cada vez más para producir terapias para combatir el cáncer y otras enfermedades, como enfermedades infecciosas y trastornos neurodegenerativos .
El silenciamiento de genes a menudo se considera lo mismo que la destrucción de genes . [3] [4] Cuando los genes son silenciados, su expresión se reduce. [3] [4] Por el contrario, cuando los genes son eliminados, se borran completamente del genoma del organismo y, por lo tanto, no tienen expresión. [3] [4] El silenciamiento de genes se considera un mecanismo de eliminación de genes ya que los métodos utilizados para silenciar genes, como ARNi , CRISPR o ARNip , generalmente reducen la expresión de un gen en al menos un 70%, pero no lo eliminan [ cita necesario ] . Los métodos que utilizan el silenciamiento de genes a menudo se consideran mejores que los genes knockout [ cita necesaria ] , ya que permiten a los investigadores estudiar genes esenciales que son necesarios para que los modelos animales sobrevivan y no pueden eliminarse. Además, proporcionan una visión más completa sobre el desarrollo de las enfermedades, ya que las enfermedades generalmente están asociadas a genes que tienen una expresión reducida. [3]
Los oligonucleótidos antisentido fueron descubiertos en 1978 por Paul Zamecnik y Mary Stephenson. [5] Los oligonucleótidos , que son fragmentos cortos de ácido nucleico , se unen a moléculas de ARNm diana complementarias cuando se añaden a la célula. [5] [6] Estas moléculas pueden estar compuestas de ADN o ARN monocatenario y generalmente tienen entre 13 y 25 nucleótidos de longitud. [6] [7] Los oligonucleótidos antisentido pueden afectar la expresión génica de dos maneras: mediante el uso de un mecanismo dependiente de RNasa H o mediante el uso de un mecanismo de bloqueo estérico. [6] [7] Los oligonucleótidos dependientes de la ARNasa H hacen que las moléculas de ARNm diana se degraden, mientras que los oligonucleótidos bloqueadores estéricos previenen la traducción de la molécula de ARNm. [6] [7] La mayoría de los fármacos antisentido funcionan a través del mecanismo dependiente de la RNasa H, en el que la RNasa H hidroliza la cadena de ARN del heterodúplex ADN/ARN . [6] [7] expresión. [6]
Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas que se utilizan para inhibir la expresión genética . Estas moléculas funcionan escindiendo moléculas de ARNm , esencialmente silenciando los genes que las produjeron. Sidney Altman y Thomas Cech descubrieron por primera vez moléculas catalíticas de ARN, la RNasa P y las ribozimas intrones del grupo II, en 1989 y ganaron el Premio Nobel por su descubrimiento. [8] [9] Existen varios tipos de motivos de ribozimas, incluidos los de cabeza de martillo , horquilla , virus de la hepatitis delta , grupo I , grupo II y ribozimas RNasa P. Los motivos de ribozima del virus del cabeza de martillo, la horquilla y la hepatitis delta (HDV) generalmente se encuentran en virus o ARN viroides. [8] Estos motivos son capaces de autoescindir un enlace fosfodiéster específico en una molécula de ARNm. [8] Los eucariotas inferiores y algunas bacterias contienen ribozimas del grupo I y del grupo II. [8] Estos motivos pueden autoempalmarse escindiendo y uniendo enlaces fosfodiéster. [8] El último motivo de ribozima, la ribozima RNasa P, se encuentra en Escherichia coli y es conocida por su capacidad para escindir los enlaces fosfodiéster de varios precursores de ARNt cuando se unen a un cofactor proteico. [8]
El mecanismo catalítico general utilizado por las ribozimas es similar al mecanismo utilizado por las proteínas ribonucleasas . [10] Estas moléculas catalíticas de ARN se unen a un sitio específico y atacan el fosfato vecino en la columna vertebral del ARN con su oxígeno 2', que actúa como un nucleófilo , lo que resulta en la formación de productos escindidos con un fosfato cíclico 2'3' y un extremo terminal hidroxilo 5'. [10] Este mecanismo catalítico ha sido utilizado cada vez más por los científicos para realizar la escisión de secuencia específica de moléculas de ARNm objetivo. Además, se están intentando utilizar ribozimas para producir terapias de silenciamiento de genes, que silenciarían los genes responsables de causar enfermedades. [11]
La interferencia de ARN ( ARNi ) es un proceso natural utilizado por las células para regular la expresión genética. Fue descubierto en 1998 por Andrew Fire y Craig Mello , quienes ganaron el Premio Nobel por su descubrimiento en 2006. [12] El proceso para silenciar genes comienza primero con la entrada de una molécula de ARN bicatenario (ARNds) en la célula, que desencadena la vía del ARNi. [12] La molécula de doble cadena luego se corta en pequeños fragmentos de doble cadena mediante una enzima llamada Dicer . [12] Estos pequeños fragmentos, que incluyen pequeños ARN de interferencia (ARNip) y microARN (miARN) , tienen aproximadamente entre 21 y 23 nucleótidos de longitud. [12] [13] Los fragmentos se integran en una proteína de múltiples subunidades llamada complejo silenciador inducido por ARN , que contiene proteínas Argonautas que son componentes esenciales de la vía de ARNi. [12] [13] Una hebra de la molécula, llamada hebra "guía", se une a RISC, mientras que la otra hebra, conocida como hebra "pasajera", se degrada. [12] [13] La cadena guía o antisentido del fragmento que permanece unido a RISC dirige el silenciamiento específico de secuencia de la molécula de ARNm objetivo. [13] Los genes pueden ser silenciados por moléculas de ARNip que provocan la escisión endonucleática de las moléculas de ARNm diana o por moléculas de miARN que suprimen la traducción de la molécula de ARNm. [13] Con la escisión o represión traduccional de las moléculas de ARNm, los genes que las forman quedan esencialmente inactivos. [12] Se cree que el ARNi evolucionó como un mecanismo de defensa celular contra invasores, como los virus de ARN , o para combatir la proliferación de transposones dentro del ADN de una célula. [12] Tanto los virus de ARN como los transposones pueden existir como ARN bicatenario y conducir a la activación de ARNi. [12] Actualmente, los ARNip se utilizan ampliamente para suprimir la expresión de genes específicos y evaluar la función de los genes . Las empresas que utilizan este enfoque incluyen Alnylam , Sanofi , [14] Arrowhead, Discerna, [15] y Persomics , [16] entre otras.
Las tres principales regiones no traducidas (3'UTR) de los ARN mensajeros (ARNm) a menudo contienen secuencias reguladoras que provocan postranscripcionalmente el silenciamiento de genes. Estas 3'-UTR contienen a menudo tanto sitios de unión para microARN (miARN) como para proteínas reguladoras . Al unirse a sitios específicos dentro de la 3'-UTR, una gran cantidad de miARN específicos disminuyen la expresión génica de sus ARNm objetivo particulares al inhibir la traducción o causar directamente la degradación del transcrito, utilizando un mecanismo similar a la interferencia del ARN (ver MicroARN ). La 3'-UTR también puede tener regiones silenciadoras que se unen a proteínas represoras que inhiben la expresión de un ARNm. [ cita necesaria ]
La 3'-UTR a menudo contiene elementos de respuesta de microARN (MRE) . Los MRE son secuencias a las que se unen los miARN y provocan el silenciamiento de genes. Estos son motivos predominantes dentro de las 3'-UTR. Entre todos los motivos reguladores dentro de las 3'-UTR (por ejemplo, incluidas las regiones silenciadoras), los MRE constituyen aproximadamente la mitad de los motivos. [ cita necesaria ]
En 2014, el sitio web miRBase , [17] un archivo de secuencias y anotaciones de miARN, enumeró 28.645 entradas en 233 especies biológicas. De estos, 1.881 miARN estaban en loci de miARN humanos anotados. Se predijo que cada uno de los miARN tendría un promedio de aproximadamente cuatrocientos ARNm diana (lo que provocaría el silenciamiento genético de varios cientos de genes). [18] Freidman et al. [18] estiman que >45.000 sitios objetivo de miARN dentro de las 3'UTR de ARNm humano se conservan por encima de los niveles de fondo, y >60% de los genes codificadores de proteínas humanas han estado bajo presión selectiva para mantener el emparejamiento con los miARN. [ cita necesaria ]
Los experimentos directos muestran que un solo miARN puede reducir la estabilidad de cientos de ARNm únicos. [19] Otros experimentos muestran que un solo miARN puede reprimir la producción de cientos de proteínas, pero que esta represión a menudo es relativamente leve (menos de 2 veces). [20] [21]
Los efectos de la desregulación de la expresión genética de los miARN parecen ser importantes en el cáncer. [22] Por ejemplo, en los cánceres gastrointestinales, se han identificado nueve miARN como alterados epigenéticamente y eficaces para regular a la baja las enzimas reparadoras del ADN. [23]
Los efectos de la desregulación de la expresión genética de los miARN también parecen ser importantes en los trastornos neuropsiquiátricos , como la esquizofrenia, el trastorno bipolar, la depresión mayor, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y los trastornos del espectro autista. [24] [25] [26]
Los investigadores han utilizado ampliamente técnicas de silenciamiento genético para estudiar genes asociados con trastornos. Estos trastornos incluyen cáncer , enfermedades infecciosas , enfermedades respiratorias y trastornos neurodegenerativos . El silenciamiento genético también se está utilizando actualmente en esfuerzos de descubrimiento de fármacos, como la letalidad sintética , la detección de alto rendimiento y las pruebas de ARNi miniaturizadas. [ cita necesaria ]
La interferencia de ARN se ha utilizado para silenciar genes asociados con varios cánceres. En estudios in vitro de leucemia mielógena crónica (LMC) , se utilizó ARNip para escindir la proteína de fusión BCR-ABL , que impide que el fármaco Gleevec ( imatinib ) se una a las células cancerosas. [27] La escisión de la proteína de fusión redujo la cantidad de células hematopoyéticas transformadas que se diseminaron por todo el cuerpo al aumentar la sensibilidad de las células al fármaco. [27] La interferencia de ARN también se puede utilizar para atacar mutantes específicos. Por ejemplo, los ARNip pudieron unirse específicamente a las moléculas p53 supresoras de tumores que contenían una mutación puntual única y destruirlas, dejando intacto el supresor de tipo salvaje. [28]
Los receptores implicados en las vías mitogénicas que conducen al aumento de la producción de células cancerosas también han sido el objetivo de las moléculas de ARNip. El receptor de quimiocina 4 (CXCR4) , asociado con la proliferación del cáncer de mama, fue escindido por moléculas de ARNip que redujeron el número de divisiones comúnmente observadas por las células cancerosas. [29] Los investigadores también han utilizado ARNip para regular selectivamente la expresión de genes relacionados con el cáncer. Las proteínas antiapoptóticas, como la clusterina y la survivina , a menudo se expresan en las células cancerosas. [30] [31] Se utilizaron ARNip dirigidos a clusterina y survivina para reducir la cantidad de proteínas antiapoptóticas y, por lo tanto, aumentar la sensibilidad de las células cancerosas a los tratamientos de quimioterapia. [30] [31] Los estudios in vivo también se utilizan cada vez más para estudiar el uso potencial de moléculas de ARNip en terapias contra el cáncer. Por ejemplo, se descubrió que los ratones a los que se les implantaron células de adenocarcinoma de colon sobrevivieron más tiempo cuando las células fueron tratadas previamente con ARNip dirigidos a la B-catenina en las células cancerosas. [32]
Los genes virales y los genes del huésped que son necesarios para que los virus se repliquen o entren en la célula, o que desempeñan un papel importante en el ciclo de vida del virus, suelen ser el objetivo de las terapias antivirales. El ARNi se ha utilizado para atacar genes en varias enfermedades virales, como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y la hepatitis . [33] [34] En particular, se utilizó ARNip para silenciar el receptor primario de quimiocinas 5 del VIH (CCR5). [35] Esto impidió que el virus ingresara a los linfocitos de la sangre periférica humana y a las células madre hematopoyéticas primarias. [35] [36] Se utilizó una técnica similar para disminuir la cantidad del virus detectable en las células infectadas con hepatitis B y C. En la hepatitis B, se utilizó el silenciamiento de ARNip para atacar el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B y condujo a una disminución en la cantidad de componentes virales. [37] Además, las técnicas de ARNip utilizadas en la hepatitis C pudieron reducir la cantidad del virus en la célula en un 98%. [38] [39]
La interferencia de ARN se ha utilizado comercialmente para controlar las enfermedades virales de las plantas durante más de 20 años (consulte Resistencia a las enfermedades de las plantas ). En 1986-1990, se publicaron múltiples ejemplos de "resistencia mediada por proteínas de cubierta" contra virus de plantas, antes de que se descubriera el ARNi. [40] En 1993, el trabajo con el virus del grabado del tabaco demostró por primera vez que los organismos huéspedes pueden atacar secuencias específicas de virus o ARNm para su degradación, y que esta actividad es el mecanismo detrás de algunos ejemplos de resistencia a virus en plantas transgénicas. [41] [42] El descubrimiento de pequeños ARN de interferencia (el determinante de la especificidad en el silenciamiento de genes mediado por ARN) también utilizó el silenciamiento de genes postranscripcional inducido por virus en plantas. [43] En 1994, se habían generado variedades de calabaza transgénicas que expresaban genes de proteínas de cubierta de tres virus diferentes, proporcionando híbridos de calabaza con resistencia multiviral validada en el campo que siguen en uso comercial en la actualidad. Las líneas de papa que expresan secuencias virales de replicasa que confieren resistencia al virus del enrollamiento de la hoja de la papa se vendieron con los nombres comerciales NewLeaf Y y NewLeaf Plus, y fueron ampliamente aceptadas en la producción comercial entre 1999 y 2001, hasta que McDonald's Corp. decidió no comprar papas transgénicas y Monsanto decidió cerrar su negocio de patatas NatureMark. [44] Otro ejemplo frecuentemente citado de resistencia a virus mediada por el silenciamiento genético involucra a la papaya, donde la industria de la papaya hawaiana fue rescatada por papayas transgénicas resistentes a virus producidas y autorizadas por investigadores universitarios en lugar de una gran corporación. [45] Estas papayas también se siguen utilizando en la actualidad, aunque no sin importantes protestas públicas, [46] [47] lo que es notablemente menos evidente en los usos médicos del silenciamiento genético.
También se han utilizado técnicas de silenciamiento genético para atacar otros virus, como el virus del papiloma humano , el virus del Nilo Occidental y el virus de Tulane. Se atacó el gen E6 en muestras de tumores recuperadas de pacientes con el virus del papiloma humano y se descubrió que causaba apoptosis en las células infectadas. [48] Los vectores de expresión de ARNip plasmídicos utilizados para atacar el virus del Nilo Occidental también pudieron prevenir la replicación de virus en líneas celulares. [49] Además, se ha descubierto que el ARNip tiene éxito en prevenir la replicación del virus Tulane, parte de la familia de virus Caliciviridae , al atacar sus genes estructurales y no estructurales. [50] Al apuntar al gen NTPasa, se demostró que una dosis de ARNip 4 horas antes de la infección controlaba la replicación del virus Tulane durante 48 horas después de la infección, reduciendo el título viral hasta en 2,6 logaritmos. [50] Aunque el virus Tulane es específico de cada especie y no afecta a los humanos, se ha demostrado que está estrechamente relacionado con el norovirus humano , que es la causa más común de gastroenteritis aguda y brotes de enfermedades transmitidas por alimentos en los Estados Unidos. [51] Los norovirus humanos son conocidos por ser difíciles de estudiar en el laboratorio, pero el virus Tulane ofrece un modelo a través del cual estudiar esta familia de virus con el objetivo clínico de desarrollar terapias que puedan usarse para tratar enfermedades causadas por norovirus humanos. [ cita necesaria ]
A diferencia de los virus, las bacterias no son tan susceptibles al silenciamiento mediante ARNip. [52] Esto se debe en gran medida a cómo se replican las bacterias. Las bacterias se replican fuera de la célula huésped y no contienen la maquinaria necesaria para que funcione el ARNi. [52] Sin embargo, las infecciones bacterianas aún se pueden suprimir mediante ARNip dirigiéndose a los genes del huésped que participan en la respuesta inmune causada por la infección o dirigiéndose a los genes del huésped involucrados en la mediación de la entrada de bacterias a las células. [52] [53] Por ejemplo, se utilizó ARNip para reducir la cantidad de citoquinas proinflamatorias expresadas en las células de ratones tratados con lipopolisacárido (LPS) . [52] [54] La expresión reducida de la citocina inflamatoria, factor de necrosis tumoral α (TNFα) , a su vez, provocó una reducción en el shock séptico que sintieron los ratones tratados con LPS. [54] Además, se utilizó ARNip para evitar que la bacteria Psueomonas aeruginosa invada las células epiteliales del pulmón murino al desactivar el gen caveolina-2 (CAV2). [55] Por lo tanto, aunque las bacterias no pueden ser atacadas directamente por los mecanismos de ARNip, aún pueden verse afectadas por el ARNip cuando se atacan los componentes involucrados en la infección bacteriana. [ cita necesaria ]
Se han utilizado ribozimas, oligonucleótidos antisentido y, más recientemente, ARNi para atacar las moléculas de ARNm implicadas en el asma . [53] [56] Estos experimentos han sugerido que el ARNip se puede utilizar para combatir otras enfermedades respiratorias, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y la fibrosis quística . [53] La EPOC se caracteriza por hiperplasia de células caliciformes e hipersecreción de moco . [57] Se descubrió que la secreción de moco se reducía cuando el ARNip atacaba el factor de crecimiento transformante (TGF)-α en células epiteliales de las vías respiratorias humanas NCI-H292 . [58] Además de la hipersecreción de moco, la inflamación crónica y el tejido pulmonar dañado son característicos de la EPOC y el asma. Se cree que el factor de crecimiento transformante TGF-β desempeña un papel en estas manifestaciones. [59] [60] Como resultado, cuando se usó interferón (IFN)-γ para derribar el TGF-β, mejoró la fibrosis de los pulmones, causada por daños y cicatrices en el tejido pulmonar. [61] [62]
La enfermedad de Huntington (EH) es el resultado de una mutación en el gen de la Huntingtina que provoca un exceso de repeticiones CAG. [63] El gen luego forma una proteínahuntingtina mutada con repeticiones de poliglutamina cerca del extremo amino . [64] Esta enfermedad es incurable y se sabe que causa déficits motores, cognitivos y de comportamiento. [65] Los investigadores han estado buscando el silenciamiento genético como una posible terapia para la EH. [ cita necesaria ]
El silenciamiento genético se puede utilizar para tratar la EH dirigiéndose a la proteínahuntingtina mutante. La proteína Huntingtina mutante ha sido atacada mediante el silenciamiento de genes que es específico de alelo utilizando oligonucleótidos específicos de alelo . En este método, los oligonucleótidos antisentido se utilizan para apuntar al polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) , que son cambios de un solo nucleótido en la secuencia del ADN, ya que se ha descubierto que los pacientes con EH comparten SNP comunes que están asociados con el alelo de la Huntingtina mutado. Se ha descubierto que aproximadamente el 85 % de los pacientes con EH pueden quedar cubiertos cuando se apuntan a tres SNP. Además, cuando se utilizaron oligonucleótidos antisentido para apuntar a un SNP asociado a la EH en ratones, hubo una disminución del 50 % en la proteínahuntingtina mutante. [63]
También se ha utilizado el silenciamiento de genes no específicos de alelos utilizando moléculas de ARNip para silenciar las proteínashuntingtina mutantes. A través de este enfoque, en lugar de apuntar a los SNP de la proteína mutada, se apunta a todas las proteínas de lahuntina normales y mutadas. Cuando se estudió en ratones, se descubrió que el ARNip podía reducir los niveles de Huntingtina normales y mutantes en un 75%. En este nivel, descubrieron que los ratones desarrollaron un mejor control motor y una tasa de supervivencia más larga en comparación con los controles. [63] Por lo tanto, los métodos de silenciamiento genético pueden resultar beneficiosos en el tratamiento de la EH.
La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) , también llamada enfermedad de Lou Gehrig, es una enfermedad de la neurona motora que afecta el cerebro y la médula espinal . La enfermedad hace que las neuronas motoras se degeneren, lo que eventualmente conduce a la muerte neuronal y a la degeneración muscular. [66] Se ha descubierto que cientos de mutaciones en el gen de la superóxido dismutasa de Cu/Zn (SOD1) causan ELA. [67] El silenciamiento genético se ha utilizado para eliminar el mutante SOD1 que es característico de la ELA. [67] [68] En concreto, las moléculas de ARNip se han utilizado con éxito para atacar el gen mutante SOD1 y reducir su expresión mediante el silenciamiento de genes específicos de alelo. [67] [69]
Existen varios desafíos asociados con las terapias de silenciamiento genético, incluida la administración y la especificidad de las células objetivo. Por ejemplo, para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos, se deben administrar al cerebro moléculas para una posible terapia de silenciamiento genético. La barrera hematoencefálica dificulta el transporte de moléculas al cerebro a través del torrente sanguíneo al impedir el paso de la mayoría de las moléculas que se inyectan o absorben en la sangre. [63] [64] Por lo tanto, los investigadores han descubierto que deben inyectar directamente las moléculas o implantar bombas que las empujen hacia el cerebro. [63]
Sin embargo, una vez dentro del cerebro, las moléculas deben moverse dentro de las células objetivo. Para administrar eficazmente moléculas de ARNip a las células, se pueden utilizar vectores virales . [63] [65] Sin embargo, este método de administración también puede ser problemático ya que puede provocar una respuesta inmune contra las moléculas. Además de la administración, también se ha descubierto que la especificidad es un problema en el silenciamiento de genes. Tanto los oligonucleótidos antisentido como las moléculas de ARNip pueden unirse potencialmente a la molécula de ARNm incorrecta. [63] Por lo tanto, los investigadores están buscando métodos más eficientes para administrar y desarrollar terapias de silenciamiento de genes específicos que aún sean seguras y efectivas. [ cita necesaria ]
Arctic Apples es un conjunto de manzanas de marca registrada [70] que contienen un rasgo que no se oscurece creado mediante el uso de silenciamiento genético para reducir la expresión de polifenol oxidasa (PPO). Es el primer producto alimenticio aprobado que utiliza esta técnica. [71]
{{cite journal}}: Mantenimiento CS1: DOI inactivo a partir de enero de 2024 ( enlace )