Los análogos de los ácidos nucleicos son compuestos análogos (estructuralmente similares) al ARN y al ADN naturales , utilizados en medicina y en la investigación de biología molecular. Los ácidos nucleicos son cadenas de nucleótidos, que se componen de tres partes: un esqueleto de fosfato , un azúcar pentosa, ya sea ribosa o desoxirribosa , y una de cuatro nucleobases . Un análogo puede tener cualquiera de estos alterados. [1] Normalmente, las nucleobases análogas confieren, entre otras cosas, diferentes propiedades de apareamiento y apilamiento de bases. Los ejemplos incluyen bases universales, que pueden emparejarse con las cuatro bases canónicas, y análogos de la estructura principal de fosfato-azúcar como el PNA , que afectan las propiedades de la cadena (el PNA puede incluso formar una triple hélice ). [2] Los análogos de los ácidos nucleicos también se denominan ácidos xenonucleicos y representan uno de los principales pilares de la xenobiología , el diseño de formas de vida nuevas para la naturaleza basadas en bioquímicas alternativas.
Los ácidos nucleicos artificiales incluyen ácidos nucleicos peptídicos (PNA), morfolino y ácidos nucleicos bloqueados (LNA), así como ácidos nucleicos de glicol (GNA), ácidos nucleicos de treosa (TNA) y ácidos nucleicos de hexitol (HNA). Cada uno de estos se distingue del ADN o ARN natural por cambios en la columna vertebral de la molécula. Sin embargo, la teoría del polielectrolito del gen propone que una molécula genética requiere una columna vertebral cargada para funcionar.
En mayo de 2014, los investigadores anunciaron que habían introducido con éxito dos nuevos nucleótidos artificiales en el ADN bacteriano y, al incluir nucleótidos artificiales individuales en los medios de cultivo, pudieron pasar las bacterias 24 veces; no crearon ARNm ni proteínas capaces de utilizar los nucleótidos artificiales. Los nucleótidos artificiales presentaban 2 anillos aromáticos fusionados.
Varios análogos de nucleósidos se utilizan como agentes antivirales o anticancerígenos. La polimerasa viral incorpora estos compuestos con bases no canónicas. Estos compuestos se activan en las células al convertirse en nucleótidos; se administran como nucleósidos, ya que los nucleótidos cargados no pueden atravesar fácilmente las membranas celulares. [ cita necesaria ]
Los análogos de los ácidos nucleicos se utilizan en biología molecular para varios fines:
El grupo 2' hidroxi de la ribosa reacciona con el grupo 3' hidroxi unido a fosfato, lo que hace que el ARN sea demasiado inestable para usarse o sintetizarse de manera confiable. Para superar esto, se puede utilizar un análogo de ribosa. Los análogos de ARN más comunes son el ARN sustituido con 2'-O-metilo, el ácido nucleico bloqueado (LNA) o el ácido nucleico puenteado (BNA), el morfolino , [5] [6] y el ácido peptídico nucleico ( PNA ). Aunque estos oligonucleótidos tienen un azúcar principal diferente (o, en el caso del PNA, un residuo de aminoácido en lugar del fosfato de ribosa), todavía se unen al ARN o al ADN según el emparejamiento de Watson y Crick y, al mismo tiempo, son inmunes a la actividad de la nucleasa. No pueden sintetizarse enzimáticamente y sólo pueden obtenerse sintéticamente utilizando la estrategia de la fosforamidita o, para el PNA, otros métodos de síntesis de péptidos . [ cita necesaria ]
Los didesoxinucleótidos se utilizan en la secuenciación . Estos nucleósidos trifosfatos poseen un azúcar no canónico, didesoxirribosa, que carece del grupo 3' hidroxilo normalmente presente en el ADN y, por lo tanto, no puede unirse con la siguiente base. La falta del grupo 3' hidroxilo pone fin a la reacción en cadena, ya que las ADN polimerasas lo confunden con un desoxirribonucleótido normal. Otro análogo de terminación de cadena que carece de hidroxilo 3' e imita a la adenosina se llama cordicepina . Cordycepin es un fármaco contra el cáncer que se dirige a la replicación del ARN . Otro análogo en la secuenciación es un análogo de nucleobase, 7-deaza-GTP, y se utiliza para secuenciar regiones ricas en CG; en cambio, 7-deaza-ATP se llama tubercidina, un antibiótico. [ cita necesaria ]
El ARN puede ser demasiado complejo para ser el primer ácido nucleico, por lo que antes del mundo del ARN se ofrecieron como candidatos para los primeros ácidos nucleicos varios ácidos nucleicos más simples que se diferencian en la columna vertebral, como GNA , PNA y TNA . [ cita necesaria ]
Las bases naturales se pueden dividir en dos clases según su estructura:
Se han insertado nucleótidos artificiales ( pares de bases no naturales (UBP) denominados d5SICS UBP y dNaM UBP ) en el ADN bacteriano, pero estos genes no formaron ARNm ni indujeron la síntesis de proteínas. Los nucleótidos artificiales presentaban dos anillos aromáticos fusionados que formaban un complejo (d5SICS-dNaM) que imitaba el par de bases natural (dG-dC). [7] [8] [9]
Uno de los análogos de bases más comunes es el 5-bromouracilo (5BU), la base anormal que se encuentra en el análogo de nucleótido mutagénico BrdU. Cuando se incorpora al ADN un nucleótido que contiene 5-bromouracilo, es más probable que se empareje con adenina; sin embargo, puede cambiar espontáneamente a otro isómero que se empareja con una nucleobase diferente , la guanina . Si esto sucede durante la replicación del ADN, se insertará una guanina como análogo de base opuesta y, en la siguiente replicación del ADN, esa guanina se emparejará con una citosina. Esto da como resultado un cambio en un par de bases del ADN, específicamente una mutación de transición . [ cita necesaria ]
Además, el ácido nitroso (HNO2) es un potente mutágeno que actúa sobre el ADN replicante y no replicante. Puede provocar desaminación de los grupos amino de adenina, guanina y citosina. La adenina se desamina a hipoxantina , cuya base se empareja con citosina en lugar de timina. La citosina se desamina a uracilo, cuya base se empareja con adenina en lugar de guanina. La desaminación de la guanina no es mutagénica. Las mutaciones inducidas por el ácido nitroso también se inducen a volver a mutar al tipo salvaje. [ cita necesaria ]
Comúnmente los fluoróforos (como la rodamina o la fluoresceína ) están unidos al anillo unido al azúcar (en para) a través de un brazo flexible, presumiblemente sobresaliendo del surco principal de la hélice. Debido a la baja procesividad de los nucleótidos unidos a aductos voluminosos como los floróforos mediante las [Taq polimerasas], la secuencia generalmente se copia usando un nucleótido con un brazo y luego se acopla con un fluoróforo reactivo (marcaje indirecto):
Los fluoróforos encuentran una variedad de usos en medicina y bioquímica.
El análogo de base fluorescente más comúnmente utilizado y disponible comercialmente, la 2-aminopurina (2-AP), tiene un rendimiento cuántico de alta fluorescencia libre en solución (0,68) que se reduce considerablemente (aproximadamente 100 veces, pero depende en gran medida de la secuencia de bases) cuando incorporados a los ácidos nucleicos. [10] La sensibilidad de emisión de 2-AP al entorno inmediato es compartida por otros análogos de bases fluorescentes útiles y prometedores como 3-MI, 6-MI, 6-MAP, [11] pirrolo-dC (también disponible comercialmente), [12 ] derivados modificados y mejorados de pirrolo-dC, [13] bases modificadas con furano [14] y muchos otros (ver revisiones recientes). [15] [16] [17] [18] [19] Esta sensibilidad al microambiente se ha utilizado en estudios de, por ejemplo, estructura y dinámica tanto del ADN como del ARN, dinámica y cinética de la interacción ADN-proteína y transferencia de electrones dentro del ADN. [ cita necesaria ]
Un grupo recientemente desarrollado y muy interesante de análogos de bases fluorescentes que tiene un rendimiento cuántico de fluorescencia que es casi insensible a su entorno inmediato es la familia de las citosinas tricíclicas. La 1,3-diaza-2-oxofenotiazina, tC, tiene un rendimiento cuántico de fluorescencia de aproximadamente 0,2 tanto en cadena simple como en cadena doble, independientemente de las bases circundantes. [20] [21] Además, el oxohomólogo de tC llamado tC O (ambos disponibles comercialmente), 1,3-diaza-2-oxofenoxazina, tiene un rendimiento cuántico de 0,2 en sistemas bicatenarios. [22] Sin embargo, es algo sensible a las bases circundantes en cadenas simples (rendimiento cuántico de 0,14 a 0,41). Los rendimientos cuánticos altos y estables de estos análogos de bases los hacen muy brillantes y, en combinación con sus buenas propiedades de análogos de bases (dejan la estructura y la estabilidad del ADN casi imperturbables), son especialmente útiles en anisotropía de fluorescencia y mediciones FRET, áreas donde otros los análogos de bases fluorescentes son menos precisos. Además, en la misma familia de análogos de citosina, se ha desarrollado un análogo de base aceptora de FRET, tC nitro . [23] Junto con tC O como donante de FRET, este constituye el primer par de FRET análogo de base de ácido nucleico jamás desarrollado. La familia tC se ha utilizado, por ejemplo, en estudios relacionados con los mecanismos de unión y polimerización del ADN de la polimerasa.
En una célula, hay varias bases no canónicas presentes: islas CpG en el ADN (a menudo metiladas), todos los ARNm eucariotas (cubiertos con metil-7-guanosina) y varias bases de ARNr (metiladas). A menudo, los ARNt se modifican mucho postranscripcionalmente para mejorar su conformación o emparejamiento de bases, en particular en o cerca del anticodón: la inosina puede emparejarse con C, U e incluso con A, mientras que la tiouridina (con A) es más específica que el uracilo. (con una purina). [24] Otras modificaciones comunes de las bases del ARNt son pseudouridina (que da nombre al bucle TΨC ), dihidrouridina (que no se acumula porque no es aromática), queuosina, wyosina, etc. Sin embargo, todas estas son modificaciones de bases normales y no son colocadas por una polimerasa. [24]
Las bases canónicas pueden tener un grupo carbonilo o amina en los carbonos que rodean el átomo de nitrógeno más alejado del enlace glicosídico, lo que les permite formar pares de bases (emparejamiento de bases Watson-Crick) a través de enlaces de hidrógeno (amina con cetona, purina con pirimidina). . La adenina y la 2-aminoadenina tienen uno o dos grupos amina, mientras que la timina tiene dos grupos carbonilo y la citosina y la guanina son aminas y carbonilo mixtos (invertidos entre sí). [ cita necesaria ]
Se debate la razón precisa por la que sólo hay cuatro nucleótidos, pero hay varias posibilidades no utilizadas. Además, la adenina no es la opción más estable para el emparejamiento de bases: en Cyanophage S-2L, se utiliza diaminopurina (DAP) en lugar de adenina. [25] Los pares de bases de diaminopurina se combinan perfectamente con la timina, ya que es idéntica a la adenina pero tiene un grupo amina en la posición 2 que forma 3 enlaces de hidrógeno intramoleculares, lo que elimina la principal diferencia entre los dos tipos de pares de bases (AT débil frente a CG fuerte). Esta estabilidad mejorada afecta las interacciones de unión a proteínas que dependen de esas diferencias. Otra combinación incluye:
Sin embargo, se puede formar una estructura de ADN correcta incluso cuando las bases no están emparejadas mediante enlaces de hidrógeno; es decir, las bases se emparejan gracias a la hidrofobicidad, como han demostrado estudios con isósteros del ADN (análogos con el mismo número de átomos) como el análogo de timina 2,4-difluorotolueno (F) o el análogo de adenina 4-metilbencimidazol (Z). [27] Un par hidrofóbico alternativo podría ser isoquinolina y pirrolo[2,3-b]piridina [28]
Otros pares de bases destacables:
En el apareamiento metal-base, los enlaces de hidrógeno de Watson-Crick se reemplazan por la interacción entre un ion metálico con nucleósidos que actúan como ligandos. Las posibles geometrías del metal que permitirían la formación dúplex con dos nucleósidos bidentados alrededor de un átomo metálico central son tetraédrica , dodecaédrica y plana cuadrada . La complejación de metales con ADN puede ocurrir mediante la formación de pares de bases no canónicas a partir de nucleobases naturales con la participación de iones metálicos y también mediante el intercambio de átomos de hidrógeno que forman parte del par de bases de Watson-Crick por iones metálicos. [32] Se ha demostrado que la introducción de iones metálicos en un dúplex de ADN tiene potenciales propiedades magnéticas [33] o conductoras, [34] así como una mayor estabilidad. [35]
Se ha demostrado que se produce complejación de metales entre nucleobases naturales . Un ejemplo bien documentado es la formación de T-Hg-T, que involucra dos nucleobases de timina desprotonadas que se unen mediante Hg 2+ y forman un par de base metálica conectado. [36] Este motivo no admite Hg 2+ apilado en un dúplex debido a un proceso de formación de horquilla intrahebra que se favorece sobre la formación de dúplex. [37] Dos timinas una frente a la otra no forman un par de bases de Watson-Crick en un dúplex; este es un ejemplo en el que un desajuste del par de bases de Watson-Crick se estabiliza mediante la formación del par de base metal. Otro ejemplo de un metal que forma complejos con nucleobases naturales es la formación de A-Zn-T y G-Zn-C a pH alto; Co +2 y Ni +2 también forman estos complejos. Estos son pares de bases de Watson-Crick donde el catión divalente está coordinado con las nucleobases. Se debate la vinculación exacta. [38]
Se ha desarrollado una gran variedad de nucleobases artificiales para su uso como pares de bases metálicas. Estas nucleobases modificadas exhiben propiedades electrónicas, tamaños y afinidades de unión sintonizables que pueden optimizarse para un metal específico. Por ejemplo, se ha demostrado que un nucleósido modificado con un 2,6-dicarboxilato de piridina se une estrechamente al Cu 2+ , mientras que otros iones divalentes sólo se unen débilmente. El carácter tridentado contribuye a esta selectividad. El cuarto sitio de coordinación en el cobre está saturado por una nucleobase de piridina dispuesta de manera opuesta. [39] El sistema de pares de bases metálicas asimétricas es ortogonal a los pares de bases de Watson-Crick. Otro ejemplo de nucleobase artificial es el de las nucleobases de hidroxipiridona, que son capaces de unir Cu 2+ dentro del dúplex de ADN. Se incorporaron cinco pares de bases de cobre-hidroxipiridona consecutivos en una doble hebra, que estaba flanqueada por una sola nucleobase natural en ambos extremos. Los datos del EPR mostraron que se estimó que la distancia entre los centros de cobre era de 3,7 ± 0,1 Å, mientras que un dúplex de ADN de tipo B natural es sólo ligeramente mayor (3,4 Å). [40] El atractivo de apilar iones metálicos dentro de un dúplex de ADN es la esperanza de obtener cables metálicos nanoscópicos autoensamblables, aunque esto aún no se ha realizado.
Un par de bases no naturales (UBP) es una subunidad diseñada (o nucleobase ) de ADN que se crea en un laboratorio y no se encuentra en la naturaleza. En 2012, un grupo de científicos estadounidenses liderados por Floyd Romesberg, biólogo químico del Instituto de Investigación Scripps en San Diego, California, publicó que su equipo había diseñado dos pares de bases no naturales llamados d5SICS y dNaM . [41] Más técnicamente, estos nucleótidos artificiales que contienen nucleobases hidrófobas presentan dos anillos aromáticos fusionados que forman un complejo d5SICS-dNaM o un par de bases en el ADN. [9] [42] En 2014, el mismo equipo informó que habían sintetizado un plásmido que contenía pares de bases naturales TA y CG junto con el laboratorio de UBP Romesberg de mejor rendimiento que lo había diseñado e insertado en células de la bacteria común E. coli . que replicó con éxito los pares de bases no naturales a través de múltiples generaciones. [43] Este es el primer ejemplo conocido de un organismo vivo que transmite un código genético ampliado a las generaciones posteriores. [9] [44] Esto se logró en parte mediante la adición de un gen de alga de apoyo que expresa un transportador de nucleótido trifosfato que importa eficientemente los trifosfatos de d5SICSTP y dNaMTP a la bacteria E. coli . [9] Luego, las vías de replicación bacteriana natural las utilizan para replicar con precisión el plásmido que contiene d5SICS-dNaM. [ cita necesaria ]
La incorporación exitosa de un tercer par de bases es un avance significativo hacia el objetivo de ampliar en gran medida el número de aminoácidos que puede codificar el ADN, de los 20 aminoácidos existentes a los 172 teóricamente posibles, ampliando así el potencial de los organismos vivos para producir nuevas proteínas . [43] Anteriormente, las cadenas artificiales de ADN no codificaban nada, pero los científicos especularon que podrían diseñarse para fabricar nuevas proteínas que podrían tener usos industriales o farmacéuticos. [45] La transcripción de ADN que contiene pares de bases no naturales y la traducción del ARNm correspondiente se lograron recientemente. En noviembre de 2017, el mismo equipo del Instituto de Investigación Scripps que introdujo por primera vez dos nucleobases adicionales en el ADN bacteriano informó haber construido una bacteria E. coli semisintética capaz de producir proteínas utilizando dicho ADN. Su ADN contenía seis nucleobases diferentes : cuatro canónicas y dos añadidas artificialmente, dNaM y dTPT3 (estas dos forman un par). Las bacterias tenían dos bases de ARN correspondientes incluidas en dos nuevos codones, ARNt adicionales que reconocían estos nuevos codones (estos ARNt también contenían dos nuevas bases de ARN dentro de sus anticodones) y aminoácidos adicionales, lo que permitía a las bacterias sintetizar proteínas "no naturales". [46] [47]
El grupo de Ichiro Hirao en el instituto RIKEN de Japón realizó otra demostración de UBP . En 2002, desarrollaron un par de bases no natural entre 2-amino-8-(2-tienil)purina (s) y piridina-2-ona (y) que funciona in vitro en la transcripción y traducción, para la incorporación específica de sitio de aminoácidos no estándar en proteínas. [48] En 2006, crearon 7-(2-tienil)imidazo[4,5-b]piridina (Ds) y pirrol-2-carbaldehído (Pa) como un tercer par de bases para la replicación y transcripción. [49] Posteriormente, se descubrió que Ds y 4-[3-(6-aminohexanamido)-1-propinil]-2-nitropirrol (Px) eran un par de alta fidelidad en la amplificación por PCR. [50] [51] En 2013, aplicaron el par Ds-Px a la generación de aptámeros de ADN mediante selección in vitro (SELEX) y demostraron que la expansión del alfabeto genético aumenta significativamente las afinidades de los aptámeros de ADN con las proteínas diana. [52]
Se ha propuesto y estudiado, tanto teórica como experimentalmente, la posibilidad de implementar un sistema ortogonal en el interior de las células independiente del material genético celular para realizar un sistema completamente seguro [53] , con el posible aumento de los potenciales de codificación. [54] Varios grupos se han centrado en diferentes aspectos: