La termoforesis a microescala ( MST ) es una tecnología para el análisis biofísico de interacciones entre biomoléculas . La termoforesis a microescala se basa en la detección de un cambio en la fluorescencia de un objetivo inducido por la temperatura en función de la concentración de un ligando no fluorescente. El cambio observado en la fluorescencia se basa en dos efectos distintos. Por un lado, se basa en un cambio de intensidad relacionado con la temperatura (TRIC) de la sonda fluorescente, que puede verse afectado por eventos de unión. Por otro lado, se basa en la termoforesis, el movimiento dirigido de partículas en un gradiente de temperatura microscópico . Cualquier cambio del microambiente químico de la sonda fluorescente, así como cambios en la capa de hidratación de las biomoléculas, dan como resultado un cambio relativo de la fluorescencia detectada cuando se aplica un gradiente de temperatura y puede usarse para determinar las afinidades de unión . MST permite la medición de interacciones directamente en solución sin necesidad de inmovilización a una superficie (tecnología sin inmovilización).
MST se basa en la detección cuantificable de un cambio de fluorescencia en una muestra cuando se aplica un cambio de temperatura. La fluorescencia de una molécula objetivo puede ser extrínseca o intrínseca ( aminoácidos aromáticos ) y se altera en los gradientes de temperatura debido a dos efectos distintos. Por un lado, el cambio de intensidad relacionado con la temperatura (TRIC), que describe la propiedad intrínseca de los fluoróforos de cambiar su intensidad de fluorescencia en función de la temperatura. El alcance del cambio en la intensidad de la fluorescencia se ve afectado por el entorno químico de la sonda fluorescente, que puede alterarse en eventos de unión debido a cambios conformacionales o la proximidad de ligandos . [11] [12] Por otro lado, MST también se basa en el movimiento dirigido de moléculas a lo largo de gradientes de temperatura, un efecto denominado termoforesis. Una diferencia de temperatura espacial ΔT conduce a un cambio en la concentración de moléculas en la región de temperatura elevada, cuantificada por el coeficiente de Soret S T :c caliente /c frío = exp(-S T ΔT). [13] [14] Tanto TRIC como la termoforesis contribuyen a la señal registrada en las mediciones de MST de la siguiente manera: ∂/∂T(cF)=c∂F/∂T+F∂c/∂T. El primer término de esta ecuación c∂F/∂T describe TRIC como un cambio en la intensidad de fluorescencia (F) en función de la temperatura (T), mientras que el segundo término F∂c/∂T describe la termoforesis como el cambio en la concentración de partículas. (c) en función de la temperatura. La termoforesis depende de la interfaz entre la molécula y el disolvente. En condiciones de amortiguación constantes, la termoforesis analiza el tamaño, la carga y la entropía de solvatación de las moléculas. La termoforesis de una molécula A marcada fluorescentemente difiere significativamente de la termoforesis de un complejo AT molécula-objetivo debido a diferencias de tamaño, carga y entropía de solvatación. Esta diferencia en la termoforesis de la molécula se utiliza para cuantificar la unión en experimentos de titulación en condiciones de tampón constantes.
El movimiento termoforético de la molécula marcada fluorescentemente se mide monitorizando la distribución de fluorescencia F dentro de un capilar. El gradiente de temperatura microscópico se genera mediante un láser IR, que se enfoca en el capilar y es fuertemente absorbido por el agua. La temperatura de la solución acuosa en el punto láser se eleva en ΔT=1-10 K. Antes de encender el láser IR, se observa una distribución homogénea de fluorescencia F fría dentro del capilar. Cuando se enciende el láser IR, se producen dos efectos en la misma escala de tiempo, lo que contribuye a la nueva distribución de fluorescencia F hot . La relajación térmica induce una caída dependiente de la unión en la fluorescencia del tinte debido a su respuesta local dependiente del medio ambiente al salto de temperatura (TRIC). Al mismo tiempo, las moléculas suelen moverse desde la región localmente calentada hacia las regiones frías exteriores. La concentración local de moléculas disminuye en la región calentada hasta que alcanza una distribución de estado estacionario.
Mientras que la difusión de masa D dicta la cinética de agotamiento, S T determina la relación de concentración en estado estacionario c caliente /c frío =exp(-S T ΔT) ≈ 1-S T ΔT bajo un aumento de temperatura ΔT. La norma F de fluorescencia normalizada =F caliente /F frío mide principalmente esta relación de concentración, además de TRIC ∂F/∂T. En la aproximación lineal encontramos: F norma =1+(∂F/∂TS T )ΔT. Debido a la linealidad de la intensidad de la fluorescencia y el agotamiento termoforético, la fluorescencia normalizada de la norma F de la molécula no unida (A) y la norma F del complejo unido (AT) se superponen linealmente. Al denotar x la fracción de moléculas unidas a los objetivos, la señal de fluorescencia cambiante durante la titulación del objetivo T viene dada por: F norma =(1-x) F norma (A)+x F norma (AT). [11]
Los parámetros de unión cuantitativos se obtienen utilizando una dilución en serie del sustrato de unión. Al representar gráficamente la norma F frente al logaritmo de las diferentes concentraciones de la serie de dilución, se obtiene una curva de unión sigmoidea. Esta curva de unión se puede equipar directamente con la solución no lineal de la ley de acción de masas , dando como resultado la constante de disociación KD . [15] [16] [17]
Referencias
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