La tecnología de hibridoma es un método para producir grandes cantidades de anticuerpos idénticos , también llamados anticuerpos monoclonales . Este proceso comienza inyectando a un ratón (u otro mamífero) un antígeno que provoca una respuesta inmunitaria. Un tipo de glóbulo blanco, el linfocito B , produce anticuerpos que se unen al antígeno inyectado. Estos linfocitos B productores de anticuerpos se extraen del ratón y, a su vez, se fusionan con células cancerosas de mieloma inmortales , para producir una línea celular híbrida llamada hibridoma , que tiene tanto la capacidad de producir anticuerpos del linfocito B como la longevidad y reproductividad del mieloma.
Los hibridomas pueden cultivarse en cultivos, comenzando cada cultivo con una célula de hibridoma viable, lo que produce cultivos cada uno de los cuales consta de hibridomas genéticamente idénticos que producen un anticuerpo por cultivo (monoclonales) en lugar de mezclas de diferentes anticuerpos (policlonales). La línea celular de mieloma que se utiliza en este proceso se selecciona por su capacidad de crecer en cultivos de tejidos y por la ausencia de síntesis de anticuerpos. A diferencia de los anticuerpos policlonales , que son mezclas de muchas moléculas de anticuerpos diferentes, los anticuerpos monoclonales producidos por cada línea de hibridoma son todos químicamente idénticos.
La producción de anticuerpos monoclonales fue inventada por César Milstein y Georges JF Köhler en 1975. Compartieron el Premio Nobel de Medicina y Fisiología de 1984 con Niels Kaj Jerne , quien realizó otras contribuciones a la inmunología. El término hibridoma fue acuñado por Leonard Herzenberg durante su año sabático en el laboratorio de César Milstein en 1976-1977. [1]
Los animales de laboratorio ( mamíferos , por ejemplo, ratones) se exponen primero al antígeno contra el que se va a generar un anticuerpo. Por lo general, esto se hace mediante una serie de inyecciones del antígeno en cuestión, a lo largo de varias semanas. Estas inyecciones suelen ir seguidas del uso de electroporación in vivo , que mejora significativamente la respuesta inmunitaria. Una vez que se aíslan los esplenocitos del bazo del mamífero , las células B se fusionan con células de mieloma inmortalizadas. La fusión de las células B con las células de mieloma se puede realizar mediante electrofusión. La electrofusión hace que las células B y las células de mieloma se alineen y se fusionen con la aplicación de un campo eléctrico. Alternativamente, las células B y los mielomas se pueden fusionar mediante protocolos químicos, la mayoría de las veces utilizando polietilenglicol . Las células de mieloma se seleccionan de antemano para garantizar que no estén secretando anticuerpos por sí mismas y que carezcan del gen de la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT), lo que las hace sensibles (o vulnerables) al medio HAT (ver a continuación).
Las células fusionadas se incuban en un medio HAT ( medio de hipoxantina - aminopterina - timidina ) durante aproximadamente 10 a 14 días. La aminopterina bloquea la vía que permite la síntesis de nucleótidos. Por lo tanto, las células de mieloma no fusionadas mueren, ya que no pueden producir nucleótidos por las vías de novo o de rescate porque carecen de HGPRT. La eliminación de las células de mieloma no fusionadas es necesaria porque tienen el potencial de crecer más que otras células, especialmente los hibridomas débilmente establecidos. Las células B no fusionadas mueren porque tienen una vida corta. De esta manera, solo sobreviven los híbridos de células B y mieloma, ya que el gen HGPRT que proviene de las células B es funcional. Estas células producen anticuerpos (una propiedad de las células B) y son inmortales (una propiedad de las células de mieloma). Luego, el medio incubado se diluye en placas de múltiples pocillos hasta tal punto que cada pocillo contiene solo una célula. Dado que los anticuerpos en un pocillo son producidos por la misma célula B, se dirigirán hacia el mismo epítopo y, por lo tanto, son anticuerpos monoclonales.
La siguiente etapa es un proceso rápido de detección primaria, que identifica y selecciona solo aquellos hibridomas que producen anticuerpos de especificidad apropiada. La primera técnica de detección utilizada se llama ELISA . Luego se incuban el sobrenadante del cultivo de hibridoma, el conjugado marcado con enzima secundaria y el sustrato cromogénico, y la formación de un producto coloreado indica un hibridoma positivo. Alternativamente, inmunocitoquímica, [2] transferencia Western y espectrometría de masas por inmunoprecipitación. A diferencia de los ensayos de transferencia Western, la espectrometría de masas por inmunoprecipitación facilita la detección y clasificación de clones que se unen a las formas nativas (no desnaturalizadas) de proteínas antigénicas. [3] La detección por citometría de flujo se ha utilizado para la detección primaria de una gran cantidad (~1000) de clones de hibridoma que reconocen la forma nativa del antígeno en la superficie celular. [4] En la detección basada en citometría de flujo, se utiliza una mezcla de células negativas al antígeno y células positivas al antígeno como el antígeno que se va a probar para cada muestra de sobrenadante de hibridoma. [4]
La célula B que produce los anticuerpos deseados puede clonarse para producir muchos clones hijos idénticos. Los medios complementarios que contienen interleucina-6 (como briclona) son esenciales para este paso. Una vez que se establece una colonia de hibridomas, crecerá continuamente en un medio de cultivo como RPMI-1640 (con antibióticos y suero bovino fetal) y producirá anticuerpos. [2]
Inicialmente, se utilizan placas multipocillo para cultivar los hibridomas y, después de la selección, se cambian a matraces de cultivo de tejidos más grandes. Esto mantiene el bienestar de los hibridomas y proporciona suficientes células para la criopreservación y sobrenadante para investigaciones posteriores. El sobrenadante de cultivo puede producir de 1 a 60 μg/ml de anticuerpo monoclonal, que se mantiene a -20 °C o menos hasta que se necesite. [2]
Al utilizar sobrenadante de cultivo o una preparación de inmunoglobulina purificada, se puede realizar un análisis más detallado de un hibridoma productor de anticuerpos monoclonales potenciales en términos de reactividad, especificidad y reactividad cruzada. [2]
El uso de anticuerpos monoclonales es numeroso e incluye la prevención, el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden distinguir subconjuntos de células B y células T , lo que resulta útil para identificar diferentes tipos de leucemias . Además, se han utilizado anticuerpos monoclonales específicos para definir marcadores de la superficie celular en glóbulos blancos y otros tipos de células. Esto condujo al conjunto de series de marcadores de diferenciación. Estos se denominan a menudo marcadores CD y definen varios cientos de componentes diferentes de la superficie celular de las células, cada uno especificado por la unión de un anticuerpo monoclonal particular. Dichos anticuerpos son extremadamente útiles para la clasificación celular activada por fluorescencia , el aislamiento específico de tipos particulares de células.
Con la ayuda de anticuerpos monoclonales, los tejidos y órganos pueden clasificarse en función de su expresión de ciertos marcadores definidos, que reflejan la génesis tisular o celular. El antígeno prostático específico , la fosfatasa alcalina placentaria , la gonadotropina coriónica humana , la α-fetoproteína y otros son antígenos asociados a órganos y la producción de anticuerpos monoclonales contra estos antígenos ayuda a determinar la naturaleza de un tumor primario. [2]
Los anticuerpos monoclonales son especialmente útiles para distinguir lesiones morfológicamente similares, como el mesotelioma pleural y peritoneal , el adenocarcinoma , y en la determinación del origen orgánico o tisular de metástasis indiferenciadas . Los anticuerpos monoclonales seleccionados ayudan en la detección de metástasis ocultas ( cáncer de origen primario desconocido ) mediante análisis inmunocitológico de médula ósea, otros aspirados de tejido, así como ganglios linfáticos y otros tejidos y pueden tener una mayor sensibilidad sobre la tinción histopatológica normal . [2]
En un estudio [5] se realizó un ensayo inmunohistoquímico sensible en aspirados de médula ósea de 20 pacientes con cáncer de próstata localizado. En el ensayo se utilizaron tres anticuerpos monoclonales (T16, C26 y AE-1), capaces de reconocer antígenos de membrana y citoesqueléticos expresados por células epiteliales para detectar células tumorales. Los aspirados de médula ósea del 22% de los pacientes con cáncer de próstata localizado (estadio B, 0/5; estadio C, 2/4) y del 36% de los pacientes con cáncer de próstata metastásico (estadio D1, 0/7 pacientes; estadio D2, 4/4 pacientes) tenían células positivas para antígenos en su médula ósea. Se concluyó que la tinción inmunohistoquímica de aspirados de médula ósea es muy útil para detectar metástasis ocultas en la médula ósea en pacientes con cáncer de próstata aparentemente localizado.
Aunque la inmunocitoquímica que utiliza anticuerpos monoclonales asociados a tumores ha mejorado la capacidad de detectar células ocultas de cáncer de mama en aspirados de médula ósea y sangre periférica, es necesario seguir desarrollando este método antes de que pueda utilizarse de forma rutinaria. [6] Una desventaja importante de la inmunocitoquímica es que solo se utilizan anticuerpos monoclonales asociados a tumores y no específicos de ellos, y como resultado, puede producirse cierta reacción cruzada con células normales. [7]
Para estadificar eficazmente el cáncer de mama y evaluar la eficacia de los regímenes de purga antes de la infusión de células madre autólogas, es importante detectar incluso pequeñas cantidades de células de cáncer de mama. Los métodos inmunohistoquímicos son ideales para este propósito porque son simples, sensibles y bastante específicos. Franklin et al. [8] realizaron un ensayo inmunocitoquímico sensible utilizando una combinación de cuatro anticuerpos monoclonales (260F9, 520C9, 317G5 y BrE-3) contra las glicoproteínas de la superficie de las células tumorales para identificar células tumorales de mama en la médula ósea y la sangre periférica. Concluyeron a partir de los resultados que la tinción inmunocitoquímica de la médula ósea y la sangre periférica es una forma sensible y simple de detectar y cuantificar las células de cáncer de mama.
Una de las principales causas de recidiva metastásica en pacientes con tumores sólidos es la diseminación temprana de células malignas. El uso de anticuerpos monoclonales (mAb) específicos para citoqueratinas permite identificar células tumorales epiteliales individuales diseminadas en la médula ósea.
Un estudio [9] informa sobre el desarrollo de un procedimiento inmunocitoquímico para el marcaje simultáneo del componente n.° 18 de la citoqueratina (CK18) y del antígeno prostático específico (PSA). Esto ayudaría a una mayor caracterización de las células tumorales epiteliales individuales diseminadas en pacientes con cáncer de próstata. Los doce aspirados de control de pacientes con hipertrofia prostática benigna mostraron una tinción negativa, lo que respalda aún más la especificidad de CK18 para detectar células tumorales epiteliales en la médula ósea.
En la mayoría de los casos de enfermedad maligna complicada con derrame, las células neoplásicas pueden reconocerse fácilmente. Sin embargo, en algunos casos, las células malignas no se ven tan fácilmente o su presencia es demasiado dudosa para considerarla un informe positivo. El uso de técnicas inmunocitoquímicas aumenta la precisión diagnóstica en estos casos.
Ghosh, Mason y Spriggs [10] analizaron 53 muestras de líquido pleural o peritoneal de 41 pacientes con enfermedad maligna. El examen citológico convencional no había revelado ninguna célula neoplásica. Se utilizaron tres anticuerpos monoclonales (anti-CEA, Ca 1 y HMFG-2) para buscar células malignas. Se realizó un marcaje inmunocitoquímico en frotis sin teñir, que se habían almacenado a -20 °C hasta 18 meses. Doce de los cuarenta y un casos en los que se realizó la tinción inmunocitoquímica revelaron células malignas. El resultado representó un aumento en la precisión diagnóstica de aproximadamente el 20%. El estudio concluyó que en pacientes con sospecha de enfermedad maligna, el marcaje inmunocitoquímico debe usarse de manera rutinaria en el examen de muestras citológicamente negativas y tiene implicaciones importantes con respecto al manejo del paciente.
Otra aplicación de la tinción inmunocitoquímica es la detección de dos antígenos en el mismo frotis. La tinción doble con anticuerpos de cadena ligera y con marcadores de células T y B puede indicar el origen neoplásico de un linfoma. [11]
En un estudio se ha informado del aislamiento de una línea celular de hibridoma (clon 1E10), que produce un anticuerpo monoclonal (IgM, isotipo k). Este anticuerpo monoclonal muestra una tinción inmunocitoquímica específica de los nucléolos. [12]
Los anticuerpos monoclonales permiten clasificar los tejidos y tumores en función de la expresión de determinados marcadores. Estos ayudan a distinguir lesiones morfológicamente similares y a determinar el origen orgánico o tisular de las metástasis indiferenciadas. El análisis inmunocitológico de la médula ósea, aspirados de tejido, ganglios linfáticos, etc. con anticuerpos monoclonales seleccionados ayuda a detectar metástasis ocultas. Los anticuerpos monoclonales aumentan la sensibilidad para detectar incluso pequeñas cantidades de células invasivas o metastásicas. Los anticuerpos monoclonales (mAb) específicos para las citoqueratinas pueden detectar células tumorales epiteliales individuales diseminadas en la médula ósea.