La survivina , también llamada inhibidor baculoviral de la repetición de apoptosis que contiene 5 o BIRC5 , es una proteína que, en los humanos, está codificada por el gen BIRC5 . [5] [6]
La survivina es un miembro de la familia de inhibidores de la apoptosis (IAP). La proteína survivina funciona para inhibir la activación de la caspasa , lo que conduce a la regulación negativa de la apoptosis o muerte celular programada . Esto se ha demostrado por la interrupción de las vías de inducción de survivina que conducen al aumento de la apoptosis y la disminución del crecimiento tumoral. La proteína survivina se expresa en gran medida en la mayoría de los tumores humanos y el tejido fetal, pero está completamente ausente en las células terminalmente diferenciadas. [7] Estos datos sugieren que la survivina podría proporcionar un nuevo objetivo para la terapia del cáncer que discriminaría entre células transformadas y normales. La expresión de survivina también está altamente regulada por el ciclo celular y solo se expresa en la fase G2-M. Se sabe que la survivina se localiza en el huso mitótico por interacción con la tubulina durante la mitosis y puede desempeñar un papel contribuyente en la regulación de la mitosis. Los mecanismos moleculares de la regulación de la survivina aún no se comprenden bien, pero la regulación de la survivina parece estar vinculada a la proteína p53 . También es un gen diana directa de la vía Wnt y está regulado positivamente por la beta-catenina . [8]
La survivina es un miembro de la familia IAP de proteínas antiapoptóticas . Se ha demostrado que su función se conserva a lo largo de la evolución, ya que se encuentran homólogos de la proteína tanto en vertebrados como en invertebrados . [9] Los primeros miembros de las IAP identificadas fueron las IAP del baculovirus , Cp-IAP y Op-IAP, que se unen a las caspasas y las inhiben como un mecanismo que contribuye a su eficiente ciclo de infección y replicación en el huésped. [9] Más tarde, se descubrieron cinco IAP humanas más que incluían XIAP , c-IAPl , C-IAP2 , NAIP y survivina. La survivina, como las otras, se descubrió por su homología estructural con la familia de proteínas IAP en el linfoma de células B humano . Se ha demostrado que las IAP humanas, XIAP, c-IAPl, C-IAP2 se unen a la caspasa-3 y - 7 , que son las caspasas efectoras en la vía de señalización de la apoptosis. [9] Sin embargo, no se sabe con absoluta certeza cómo las IAP inhiben la apoptosis mecanísticamente a nivel molecular.
Una característica común que está presente en todos los IAP es la presencia de un BIR (repetición de IAP de baculovirus, un motivo de ~70 aminoácidos) en una a tres copias. Tamm et al. demostraron que la eliminación de BIR2 de XIAP era suficiente para provocar una pérdida de función en términos de la capacidad de XIAP para inhibir las caspasas. Esto da la implicación de que es dentro de estos motivos BIR que se encuentra la función antiapoptótica de estos IAP. El dominio BIR de la survivina muestra una secuencia similar en comparación con la de los dominios BIR de XIAP. [9]
El gen único de survivina puede dar lugar a cuatro transcripciones diferentes empalmadas alternativamente: [10]
Una característica estructural común a todas las proteínas de la familia IAP es que todas contienen al menos un dominio de repetición IAP baculoviral ( BIR ) caracterizado por un motivo Cys/His de coordinación de zinc conservado en la mitad N-terminal de la proteína. [11] [12]
La survivina se distingue de otros miembros de la familia IAP en que tiene solo un dominio BIR. [11] [12] El dominio BIR de los ratones y humanos de la survivina son muy similares estructuralmente excepto por dos diferencias que pueden afectar la variabilidad de la función. La survivina humana también contiene una hélice C-terminal alargada que comprende 42 aminoácidos. [11] [12] La survivina tiene un tamaño de 16,5 kDa y es el miembro más pequeño de la familia IAP. [11] [12] La cristalografía de rayos X ha mostrado que dos moléculas de survivina humana se unen para formar un dímero con forma de moño a través de una interfaz hidrofóbica. [11] [12] Esta interfaz incluye los residuos N-terminales 6-10 justo antes de la región del dominio BIR y la región de 10 residuos que conecta el dominio BIR a la hélice C-terminal. [11] [12] La integridad estructural de la estructura cristalina determinada de la survivina es bastante confiable, ya que se utilizaron condiciones fisiológicas para obtener las imágenes.
La apoptosis , el proceso de muerte celular programada, implica vías de señalización complejas y cascadas de eventos moleculares. Este proceso es necesario para el desarrollo adecuado durante el crecimiento embrionario y fetal, donde hay destrucción y reconstrucción de estructuras celulares. En los organismos adultos, la apoptosis es necesaria para mantener el tejido diferenciado al lograr el equilibrio entre la proliferación y la muerte celular. Se sabe que las proteasas intracelulares llamadas caspasas degradan el contenido celular de la célula mediante proteólisis tras la activación de la vía de muerte.
Las células de mamíferos tienen dos vías principales que conducen a la apoptosis.
1. Vía extrínseca : iniciada por ligandos extrínsecos que se unen a receptores de muerte en la superficie de la célula. Un ejemplo de esto es la unión del factor de necrosis tumoral alfa ( TNF-alfa ) al receptor de TNF-alfa . Un ejemplo de un receptor de TNF es Fas ( CD95 ), que recluta caspasas activadoras como la caspasa-8 al unirse al TNF en la superficie celular. La activación de las caspasas iniciadoras inicia entonces una cascada de eventos que da como resultado la inducción de caspasas efectoras que funcionan en la apoptosis. [9] [13]
2. Vía intrínseca : Esta vía se inicia por estímulos intracelulares o ambientales. Se centra en detectar el funcionamiento inadecuado de las mitocondrias en la célula y, como resultado, activa vías de señalización para cometer suicidio. La permeabilidad de la membrana de las mitocondrias aumenta y se liberan proteínas particulares en el citoplasma que facilitan la activación de las caspasas iniciadoras. La proteína particular liberada de las mitocondrias es el citocromo c . El citocromo c luego se une a Apaf-1 en el citosol y da como resultado la activación de la caspasa iniciadora-9. La activación de las caspasas iniciadoras luego inicia una cascada de eventos descendente que da como resultado la inducción de caspasas efectoras que funcionan en la apoptosis. [9] [13]
Una familia de proteínas llamadas IAP desempeña un papel en la regulación de la muerte celular al inhibir el proceso. Las IAP, como la survivina, inhiben la apoptosis al unirse físicamente a la caspasa e inhibir su función adecuada. [9] La función de las IAP se conserva evolutivamente, ya que se ha demostrado que los homólogos de las IAP en Drosophila son esenciales para la supervivencia celular. [9]
En algunos estudios se ha implicado a los IAP como agentes reguladores de la división celular. Las células de levadura con genes IAP eliminados no mostraron problemas asociados con la muerte celular, pero sí defectos en la mitosis caracterizados por una segregación cromosómica inadecuada o una citocinesis fallida. [9]
La eliminación de IAP particulares no parece tener un efecto profundo en la vía de muerte celular, ya que existe una redundancia de función por parte de los muchos IAP que existen en una célula. [9] Sin embargo, se ha implicado a estos en el mantenimiento de un entorno antiapoptótico intracelular. El cambio de la expresión de IAP particulares ha demostrado un aumento en la inducción de muerte celular espontánea o una mayor sensibilidad a los estímulos de muerte. [9]
Tamm et al. han demostrado que la survivina inhibe las vías apoptóticas inducidas por Bax y Fas . [9] El experimento implicó la transfección de células HEK 293 con un plásmido que codifica Bax, lo que resultó en un aumento de la apoptosis (~7 veces) medido por tinción DAPI . [9] Luego, cotransfectaron las células 293 con plásmido que codifica Bax y plásmidos que codifican survivina. Observaron que las células transfectadas junto con la survivina mostraron una disminución significativa de la apoptosis (~3 veces). Un resultado similar también se mostró para las células transfectadas con el plásmido que sobreexpresa Fas. Se realizaron inmunotransferencias y se confirmó que la survivina no inhibe por mecanismo de prevención de que la proteína Bax o Fas se convierta en proteínas completamente funcionales. [9] Por lo tanto, la survivina debería estar actuando en algún lugar aguas abajo de la vía de señalización de Bax o Fas para inhibir la apoptosis a través de estas vías. [9]
En esta parte del experimento, Tamm et al. transfectaron 293 células con survivina y las lisaron para obtener lisado celular. Los lisados se incubaron con diferentes formas de caspasa y la survivina se inmunoprecipitó con un anticuerpo anti-survivina. La idea detrás de esto es que, si la survivina se une físicamente con la caspasa con la que se incuba, se coprecipitará junto con la survivina mientras que todo lo demás en el lisado se elimina por lavado. Los inmunoprecipitados se analizaron luego en SDS-PAGE y luego se inmunotransfirieron para detectar la caspasa deseada. Si se detectaba la caspasa de interés, significaba que se había unido a la survivina en el paso de inmunoprecipitación, lo que implica que la survivina y la caspasa en particular se habían unido de antemano. La caspasa-3 y -7 activas se co-inmunoprecipitaron con la survivina. Las proformas inactivas de la caspasa-3 y -7 no se unieron a la survivina. [9] La survivina tampoco se une a la caspasa-8 activa. [9] La caspasa-3 y -7 son proteasas efectoras, mientras que la caspasa-8 es una caspasa iniciadora que se encuentra más arriba en la vía apoptótica. [9] Estos resultados demuestran la capacidad de la survivina para unirse a caspasas particulares in vitro , pero no necesariamente se pueden trasladar a las condiciones fisiológicas reales. Más tarde, un estudio de 2001 confirmó que la survivina humana se une firmemente a la caspasa-3 y -7 cuando se expresa en E. coli . [14]
Tamm et al. aportaron más pruebas que respaldan la idea de que la survivina bloquea la apoptosis inhibiendo directamente las caspasas. Transfectaron 293 células con plásmidos codificantes de caspasa-3 o -7 sobreexpuestos y con survivina. Demostraron que la survivina inhibía el procesamiento de estas dos caspasas en sus formas activas. Aunque se ha demostrado que la survivina, como se mencionó anteriormente, se une únicamente a las formas activas de estas caspasas, es probable que en este caso la survivina inhiba las formas activas de las caspasas resultantes de la escisión y activación de más de sus propias proformas. Por tanto, es posible que la survivina actúe evitando que se produzca dicha cascada de amplificación de la escisión y la activación, lo que da lugar a una disminución de la apoptosis. [9]
De manera similar, al observar la vía mitocondrial de la apoptosis, se expresó transitoriamente el citocromo c en 293 células para observar los efectos inhibidores que tenía la survivina sobre esta vía. Aunque los detalles no se encuentran aquí, se demostró que la survivina también inhibe la activación de las caspasas inducida por el citocromo c y la caspasa-8. [9]
Aunque no se conoce el mecanismo por el cual la survivina puede regular la mitosis y la citocinesis celular , las observaciones realizadas sobre su localización durante la mitosis sugieren firmemente que está involucrada de alguna manera en el proceso citocinético.
Las células Daoy en proliferación se colocaron en un cubreobjetos de vidrio, se fijaron y se tiñeron con anticuerpos fluorescentes para survivina y alfa-tubulina. Se utilizó inmunofluorescencia mediante microscopía confocal para observar la localización de survivina y tubulina durante el ciclo celular y buscar patrones de expresión de survivina. La survivina estuvo ausente en la interfase , pero presente en la fase G2 - M . [10]
Durante las diferentes etapas de la mitosis, se puede observar que la survivina sigue un cierto patrón de localización. En la profase y la metafase , la survivina se encuentra principalmente en la localización nuclear. [10] Durante la profase, a medida que la cromatina se condensa para ser visible al microscopio, la survivina comienza a moverse hacia los centrómeros. [10] En la prometafase, cuando la membrana nuclear se disocia y los microtúbulos del huso cruzan la región nuclear, la survivina permanece en los centrómeros . [10] En la metafase, cuando los cromosomas se alinean en la placa media y son tirados con alta tensión hacia cualquiera de los polos por las uniones del cinetocoro , la survivina se asocia entonces con los cinetocoros. [10] En la anafase , a medida que se produce la separación de las cromátidas, los microtúbulos del cinetocoro se acortan a medida que los cromosomas se mueven hacia los polos del huso y la survivina también se mueve hacia la placa media. [10] Por tanto, la survivina se acumula en la placa media en la telofase. [10] Finalmente, la survivina se localiza en la parte media del cuerpo, en el surco de división. [10]
Se ha demostrado que la survivina puede heterodimerizarse individualmente con las dos variantes de empalme Survivin-2B y survivin-deltaEx3. [10] La evidencia de la heterodimerización de las variantes de empalme de survivina con survivin se mostró con experimentos de co-inmunoprecipitación después de la cotransfección con las respectivas variantes de survivina con survivin. Para determinar la localización de survivin-2B y survivin-deltaEx3 expresados exógenamente, se realizaron construcciones de fusión de las proteínas con GFP y HcRed respectivamente y se transfectaron células Daoy con las construcciones de plásmido. La survivina también se marcó con una proteína fluorescente. La fusión de las variantes de survivina con las moléculas fluorescentes permite una detección simple de la ubicación celular mediante microscopía de fluorescencia. Survivin-2B por sí sola, se localizó tanto en los compartimentos nuclear como citoplasmático, mientras que survivin-deltaEx3 se localizó solo en el núcleo. [10] Sin embargo, la localización de las tres variantes (survivin, survivin-2B y survivin-deltaEx3) difiere cuando se cotransfectan juntas en lugar de individualmente. [10]
Para ver qué compartimentos subcelulares contenían los complejos de variantes de empalme de survivina, se emplearon marcadores de anticuerpos fluorescentes para diferentes orgánulos de la célula. Se supone que, bajo microscopio de fluorescencia, si el complejo de survivina en particular se encuentra en ese compartimento celular en particular, se observaría una superposición de la fluorescencia emitida por el complejo de survivina marcado y el compartimento marcado también. Se utiliza una fluorescencia de diferente color para distinguir el compartimento de la survivina.
Para verificar estas observaciones, fraccionaron los compartimentos subcelulares y realizaron un análisis de transferencia Western para afirmar definitivamente que los complejos de survivina efectivamente se localizaban en estos compartimentos.
Se sabe que la survivina se expresa durante el desarrollo fetal y en la mayoría de los tipos de células tumorales, pero rara vez está presente en células adultas normales, no malignas. [15] Tamm et al. demostraron que la survivina se expresaba en las 60 líneas tumorales humanas diferentes utilizadas en el programa de detección de fármacos contra el cáncer del Instituto Nacional del Cáncer , con los niveles más altos de expresión en las líneas de cáncer de mama y pulmón y los niveles más bajos en los cánceres renales . [9] Conocer los niveles de expresión relativa de survivina en diferentes tipos de tumores puede resultar útil, ya que la terapia relacionada con survivina puede administrarse dependiendo del nivel de expresión y la dependencia del tipo de tumor de la survivina para la resistencia a la apoptosis.
La survivina puede considerarse un oncogén, ya que su sobreexpresión aberrante en la mayoría de las células cancerosas contribuye a su resistencia a los estímulos apoptóticos y a las terapias quimioterapéuticas, contribuyendo así a su supervivencia continua.
Se ha descubierto que la mayoría de los cánceres humanos presentan ganancias y pérdidas de cromosomas que pueden deberse a la inestabilidad cromosómica (CIN). Una de las causas de la CIN es la inactivación de los genes que controlan la segregación adecuada de las cromátidas hermanas durante la mitosis. Para comprender mejor la función de la survivina en la regulación mitótica, los científicos han estudiado el área de la inestabilidad genómica. Se sabe que la survivina se asocia con los microtúbulos del huso mitótico al comienzo de la mitosis. [16]
Se ha demostrado en la literatura que la eliminación de survivina en células cancerosas interrumpirá la formación de microtúbulos y dará como resultado poliploidía , así como apoptosis masiva. [16] También se ha demostrado que las células sin survivina salen de la mitosis sin lograr una alineación cromosómica adecuada y luego reforman núcleos tetraploides individuales. [16] Otra evidencia también sugiere que la survivina es necesaria para mantener el arresto mitótico al encontrarse con problemas de mitosis. [16] La evidencia mencionada anteriormente implica que la survivina juega un papel regulador importante tanto en la progresión de la mitosis como en el mantenimiento del arresto mitótico. Esto parece extraño, ya que se sabe que la survivina está altamente regulada al alza en la mayoría de las células cancerosas (que generalmente contienen características de inestabilidad cromosómica), y su función es la que promueve la regulación adecuada de la mitosis.
Se ha demostrado que el p53 de tipo salvaje reprime la expresión de survivina a nivel de ARNm. [17] Utilizando un vector de adenovirus para p53 de tipo salvaje, se transfectó la línea celular de cáncer de ovario humano 2774qw1 (que expresa p53 mutante). Los niveles de ARNm de survivina se analizaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real ( RT-PCR ) y mostraron una regulación negativa dependiente del tiempo de los niveles de ARNm de survivina cuando las células se infectaron con p53 de tipo salvaje. [17] Se observó una disminución de 3,6 veces del nivel de ARNm de survivina 16 horas después del inicio de la infección y disminuyó 6,7 veces 24 horas después de la infección. [17] Los resultados de Western blot muestran que efectivamente se estaba expresando p53 del vector adenoviral en las células utilizando anticuerpos específicos para p53. La expresión de los niveles de p53 indicativos de su papel en la represión de survivina muestra que p53 comenzó a expresarse 6 horas después de la infección y tuvo su nivel más alto a las 16-24 horas. [17] Para confirmar aún más que el p53 de tipo salvaje endógeno realmente está causando la represión de la expresión del gen de survivina, los autores indujeron células A549 (línea celular de cáncer de pulmón humano con p53 de tipo salvaje) y T47D (línea celular de cáncer de mama humano con p53 mutante) con el agente que daña el ADN adriamicina para desencadenar la respuesta apoptótica fisiológica de p53 en estas células cancerosas y comparar los niveles de survivina medidos con las mismas células sin inducción de daño del ADN. La línea A549, que intrínsecamente tiene p53 de tipo salvaje funcional, mostró una reducción significativa en los niveles de survivina en comparación con las células no inducidas. [17] Este mismo efecto no se observó en las células T47D que portan p53 inactivo mutante. [17]
La función normal de p53 es regular los genes que controlan la apoptosis. Como la survivina es un inhibidor conocido de la apoptosis, se puede deducir que la represión de la survivina por p53 es un mecanismo por el cual las células pueden experimentar apoptosis tras la inducción por estímulos o señales apoptóticas. Cuando la survivina se sobreexpresa en las líneas celulares mencionadas en el párrafo anterior, la respuesta apoptótica del agente que daña el ADN, adriamicina, disminuye de manera dependiente de la dosis. [17] Esto sugiere que la regulación negativa de la survivina por p53 es importante para que la vía apoptótica mediada por p53 dé como resultado con éxito la apoptosis. Se sabe que una característica definitoria de la mayoría de los tumores es la sobreexpresión de survivina y la pérdida completa de p53 de tipo salvaje. [17] La evidencia presentada por Mirza et al. muestra que existe un vínculo entre la survivina y p53 que posiblemente pueda explicar un evento crítico que contribuye a la progresión del cáncer.
Para ver si la reexpresión de p53 en células cancerosas (que han perdido la expresión de p53) tiene un efecto supresor sobre el promotor del gen de survivina, se realizó un constructo de reportero de luciferasa. El promotor de survivina aislado se colocó aguas arriba del gen reportero de luciferasa. En un ensayo de reportero de luciferasa, si el promotor está activo, el gen de luciferasa se transcribe y se traduce en un producto que emite luz que se puede medir cuantitativamente y, por lo tanto, representa la actividad del promotor. Este constructo se transfectó en células cancerosas que tenían p53 de tipo salvaje o mutante. Se midió una alta actividad de luciferasa en las células con p53 mutante y se midieron niveles de luciferasa significativamente más bajos en las células con p53 de tipo salvaje. [17]
La transfección de diferentes tipos de células con p53 de tipo salvaje se asoció con una fuerte represión del promotor de survivina. [17] No se demostró que la transfección con p53 mutante reprimiera fuertemente el promotor de survivina. [17] Se prepararon más construcciones de luciferasa con diversos grados de deleción del extremo 5' de la región promotora de survivina. En un momento dado, hubo una deleción que provocó que los niveles de survivina fueran indiferentes a la presencia del plásmido de sobreexpresión de p53, lo que indica que existe una región específica próxima al sitio de inicio de la transcripción que es necesaria para la supresión de survivina por p53. [17] Aunque se ha descubierto que dos sitios de unión de p53 se encuentran en el promotor del gen de survivina, el análisis mediante deleciones y mutaciones ha demostrado que estos sitios no son esenciales para la inactivación transcripcional. [17]
En cambio, se observa que la modificación de la cromatina dentro de la región promotora puede ser responsable de la represión transcripcional del gen de la survivina. Esto se explica más adelante en la sección de regulación epigenética. [17]
Se ha demostrado que la survivina está claramente regulada por el ciclo celular, ya que se ha descubierto que su expresión es dominante solo en la fase G2/M. [13] Esta regulación existe a nivel transcripcional, ya que hay evidencia de la presencia de cajas de elementos dependientes del ciclo celular/región de homología del gen del ciclo celular (CDE/CHR) ubicadas en la región promotora de la survivina. [13] Otra evidencia que apoya este mecanismo de regulación incluye la evidencia de que la survivina está poliubiquinada y degradada por los proteasomas durante la interfase del ciclo celular. [13] Además, se ha demostrado que la survivina se localiza en componentes del huso mitótico durante la metafase y la anafase de la mitosis. [13] También se ha demostrado in vitro la asociación física entre la tubulina polimerizada y la survivina. [13] También se ha demostrado que la modificación postranscripcional de la survivina que implica la fosforilación de Thr34 conduce a una mayor estabilidad de la proteína en la fase G2/M del ciclo celular. [13]
Mirza et al. saben que la represión de la survivina por p53 no es el resultado de ninguna regulación progresiva del ciclo celular. Se repitió el mismo experimento de Mirza et al. con respecto a la determinación de la supresión de la survivina por p53 a nivel transcripcional, pero esta vez para células detenidas en diferentes etapas del ciclo celular. Se demostró que, aunque p53 detiene el número de células en diferentes grados en diferentes fases, el nivel medido de ARNm y proteína de survivina fue el mismo en todas las muestras transfectadas con p53 de tipo salvaje. Esto demuestra que p53 actúa de manera independiente del ciclo celular para inhibir la expresión de survivina. [17]
Como se ha observado en la literatura, se ha descubierto que la survivina se expresa en exceso en muchos tipos de tumores. Los científicos no están seguros del mecanismo que causa esta sobreexpresión anormal de la survivina; sin embargo, la p53 está regulada a la baja en casi todos los cánceres, por lo que es tentador sugerir que la sobreexpresión de la survivina se debe a la inactividad de la p53. Wagner et al. investigaron el posible mecanismo molecular involucrado en la sobreexpresión de la survivina en la leucemia mieloide aguda (LMA). En sus experimentos, realizaron un análisis epigenético y genético de la región promotora del gen de la survivina en pacientes con LMA y compararon las observaciones con lo que se vio en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que han demostrado no expresar survivina. Suponiendo que el mecanismo molecular de la reexpresión de survivina en células cancerosas está a nivel transcripcional, los autores decidieron observar partes particulares de la región promotora de survivina para ver qué sucede en las células cancerosas que no sucede en las células normales y que causa que se exprese un nivel tan alto de survivina. Con respecto a un mecanismo epigenético de regulación del gen de survivina, los autores midieron el estado de metilación del promotor de survivina, ya que se acepta que la metilación de genes juega un papel importante en la carcinogénesis al silenciar ciertos genes o viceversa. Los autores utilizaron la reacción en cadena de la polimerasa específica de metilación con métodos de secuenciación de bisulfito para medir el estado de metilación del promotor en LMA y PBMC y encontraron promotores de survivina no metilados en ambos grupos. [18] Este resultado muestra que el estado de metilación del ADN no es un regulador importante de la reexpresión de survivina durante la leucemogénesis. [18] Sin embargo, De Carvalho et al. Se realizó un análisis de metilación del ADN y se identificó que la metilación del ADN de IRAK3 desempeña un papel clave en la sobreexpresión de survivina en diferentes tipos de cáncer, [19] lo que sugiere que los mecanismos epigenéticos desempeñan un papel indirecto en la sobreexpresión anormal de survivina. Con respecto al análisis genético de la región promotora de survivina, el ADN aislado de LMA y PBMC se trató con bisulfito, y la secuencia de la región promotora de survivina se amplificó con PCR y se secuenció para buscar cambios genéticos particulares en la secuencia de ADN entre los dos grupos. Se identificaron tres polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y todos estaban presentes tanto en pacientes con LMA como en donantes sanos. Este resultado sugiere que la aparición de estos SNP en la región promotora del gen de survivina también parece no tener importancia para la expresión de survivina. [18]Sin embargo, todavía no se ha descartado que pueda haber otros posibles mecanismos epigenéticos que puedan ser responsables de un alto nivel de expresión de survivina observado en células cancerosas y no en células normales. Por ejemplo, también se puede observar el perfil de acetilación de la región promotora de survivina. Diferentes tipos de cáncer y tejidos pueden tener diferencias leves o significativas en la forma en que se regula la expresión de survivina en la célula y, por lo tanto, se puede observar que el estado de metilación o las diferencias genéticas en el promotor de survivina son diferentes en diferentes tejidos. Por lo tanto, se deben investigar más experimentos que evalúen el perfil epigenético y genético de diferentes tipos de tumores.
Se sabe que la survivina se expresa en gran medida en la mayoría de los tipos de células tumorales y está ausente en las células normales, lo que la convierte en un buen objetivo para la terapia contra el cáncer. [20] [21] [22] [23] [24] La explotación del promotor hiperactivo de la survivina en la mayoría de los tipos de células cancerosas permite la administración de terapias solo en células cancerosas y eliminadas de las células normales. [25]
Los ARN interferentes pequeños (siRNA) son oligonucleótidos antisentido sintéticos para el ARNm del gen de interés que funcionan para silenciar la expresión de un gen particular mediante su unión complementaria. Los siRNA, como LY2181308 , unidos al ARNm respectivo dan como resultado la interrupción de la traducción de ese gen en particular y, por lo tanto, la ausencia de esa proteína en la célula. Por lo tanto, el uso de siRNA tiene un gran potencial para ser una terapia humana, ya que puede dirigirse y silenciar la expresión de potencialmente cualquier proteína que desee. Surge un problema cuando la expresión de siRNA en una célula no se puede controlar, lo que permite que su expresión constitutiva cause efectos secundarios tóxicos. Con respecto al tratamiento práctico del cáncer, se requiere administrar los siRNA específicamente en las células cancerosas o controlar la expresión de siRNA. Los métodos anteriores de terapia con siRNA emplean el uso de secuencias de siRNA clonadas en vectores bajo el control de promotores constitutivamente activos. [25] Esto causa un problema, ya que este modelo no es específico para las células cancerosas y también daña las células normales. [25] Sabiendo que la survivina se sobreexpresa específicamente en células cancerosas y está ausente en células normales, se puede inferir que el promotor de la survivina está activo solo en células cancerosas. Por lo tanto, la explotación de esta diferencia entre células cancerosas y células normales permitirá una terapia apropiada dirigida solo a las células de un paciente que son dañinas. En un experimento para demostrar esta idea, Trang et al. han creado un vector específico para el cáncer que expresa ARNi para la proteína fluorescente verde (GFP) bajo el promotor de survivina humana. Las células de cáncer de mama MCF7 se cotransfectaron con este vector y también con un vector que expresaba GFP. Su principal hallazgo fue que las células MCF7 transfectadas con el vector de ARNi para GFP bajo el promotor de survivina tuvieron una reducción significativa en la expresión de GFP que las células transfectadas con el vector de ARNi bajo un promotor no específico del cáncer. [25] Además, las células normales no cancerosas transfectadas de la misma manera mencionada anteriormente no mostraron una reducción significativa en la expresión de GFP. [25] Esto implica que, en las células normales, el promotor de survivina no está activo y, por lo tanto, el ARNi no se expresará bajo un promotor de survivina inactivo. [25]
Como se sabe, la survivina se expresa en exceso en la mayoría de los cánceres, lo que puede contribuir a la resistencia de las células cancerosas a los estímulos apoptóticos del entorno. El uso de la terapia antisentido con survivina espera hacer que las células cancerosas sean susceptibles a la apoptosis al eliminar la expresión de survivina en las células cancerosas. [8]
Olie et al. desarrollaron diferentes oligonucleótidos antisentido de fosforotioato de 20 meros que se dirigen a diferentes regiones en el ARNm del gen de survivina. La función antisentido de los oligonucleótidos permite la unión al ARNm superviviente y, dependiendo de la región a la que se una, podría inhibir la traducción del ARNm superviviente a una proteína funcional. Se utilizó PCR en tiempo real para evaluar los niveles de ARNm presentes en una línea celular de adenocarcinoma de pulmón A549 que sobreexpresa survivina. Se identificó el mejor oligonucleótido antisentido que reducía eficazmente los niveles de ARNm de survivina y provocaba la apoptosis de las células. El papel de survivina en el desarrollo del cáncer en el contexto de una vía de señalización es su capacidad para inhibir la activación de las caspasas 3 y 7 posteriores a partir de estímulos que inducen apoptosis. La sobreexpresión de survivina en tumores puede servir para aumentar la resistencia de los tumores a la apoptosis y, por lo tanto, contribuir a la inmortalidad celular incluso en presencia de estímulos de muerte. [25] En este experimento, se descubrió que el oligonucleótido 4003 que se dirige a los nucleótidos 232-251 del ARNm de survivina era el más eficaz para regular a la baja los niveles de ARNm de survivina en la línea tumoral A549. [25] Los oligonucleótidos 4003 se introdujeron en las células tumorales mediante transfección. Luego se realizaron más experimentos con 4003. Uno de los experimentos adicionales implicó determinar el efecto dependiente de la dosis de 4003 en la regulación a la baja de los niveles de ARNm de survivina. Se descubrió que una concentración de 400 nM resultó en una regulación a la baja máxima del 70% del ARNm de survivina inicial presente. [25] Otro experimento con 4003 implicó evaluar cualquier efecto biológico o citotóxico que la regulación a la baja de 4003 del ARNm de survivina tiene sobre las células A549 utilizando el ensayo MTT. La cantidad de células A549 transfectadas con 4003 disminuyó significativamente con el aumento de la concentración de 4003 en comparación con las células transfectadas con una forma no coincidente de 4003 o con el control de lipofectina. [25] Se realizaron muchas observaciones físicas que confirmaron la inducción de la apoptosis por 4003. Por ejemplo, los lisados de las células tratadas con 4003 mostraron mayores niveles de actividad de proteasa similar a la caspasa-3; se observó que los núcleos estaban condensados y la cromatina estaba fragmentada.
La survivina ha sido objeto de atención en los últimos años en el campo de la inmunoterapia contra el cáncer, ya que es un antígeno que se expresa principalmente en las células cancerosas y está ausente en las células normales. Esto se debe a que se considera que la survivina es un factor crucial en la supervivencia del tumor. Se han acumulado muchas pruebas a lo largo de los años que demuestran que la survivina es un potente antígeno activador de las células T, y ya se han iniciado ensayos clínicos para demostrar su utilidad en la clínica. [26]
A. Respuesta celular de las células T
La primera evidencia del reconocimiento y la eliminación de CTL específicos de survivina se demostró en un ensayo en el que las células T citotóxicas (CTL) indujeron la lisis de las células B transfectadas para presentar péptidos de survivina en su superficie. [26] Las células T CD8+ ingenuas fueron cebadas con células dendríticas y, por lo tanto, pudieron reconocer los péptidos específicos de survivina presentados en las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad I (MHC I) de la superficie de las células B.
B. Respuesta de anticuerpos humorales
Al tomar muestras de sangre de pacientes con cáncer, los científicos han encontrado anticuerpos específicos para la survivina. [26] Estos anticuerpos no estaban presentes en las muestras de sangre de pacientes normales sanos. [26] Por lo tanto, esto demuestra que la survivina es capaz de provocar una respuesta inmunitaria humoral completa. Esto puede resultar útil, ya que se podría medir el nivel de anticuerpos específicos contra la survivina en la sangre del paciente como un monitor de la progresión del tumor. [26] Al adquirir la respuesta humoral a antígenos tumorales como la survivina, las células T CD4+ se activan para inducir a las células B a producir anticuerpos dirigidos contra los antígenos particulares.
El aislamiento de los anticuerpos específicos para los péptidos de survivina es útil, ya que se puede observar la estructura y la secuencia del surco de unión del epítopo del anticuerpo y, por lo tanto, deducir posibles epítopos que pueden encajar en ese surco de anticuerpo en particular. [26] Por lo tanto, se puede determinar la porción peptídica particular de la proteína survivina que se une de manera más eficiente y más común por los anticuerpos humorales generados contra la survivina. Esto conducirá a la producción de vacunas de survivina más específicas que contienen una porción específica de la proteína survivina que se sabe que provoca una buena respuesta inmunitaria, genera memoria inmunitaria y permite la protección contra el desarrollo de tumores.
Xiang et al. encontraron un nuevo enfoque para inhibir el crecimiento del tumor y la metástasis al atacar simultáneamente tanto al tumor como a su vasculatura mediante una respuesta de células T citotóxicas (CTL) contra la proteína survivina, que luego dará como resultado la activación de la apoptosis en las células tumorales. [27]
La idea y el principio general de su técnica se describen a continuación. Se inmunizaron ratones con la vacuna oral y luego se los sometió a pruebas de provocación tumoral inyectándoles en el pecho una cierta cantidad de células tumorales y una matriz extracelular preformada con Matrigel para mantener unidas las células tumorales. Se sacrificó a los ratones y se tiñó el tejido endotelial con un colorante fluorescente que ayudaría a cuantificar la neovascularización tumoral mediante un ensayo con Matrigel. Se encontró una diferencia significativa entre los grupos de control y de prueba, por lo que los ratones a los que se les administró la vacuna tuvieron menos angiogénesis a partir de la prueba de provocación tumoral que los ratones de control a los que no se les administró ninguna vacuna antes de la prueba de provocación tumoral. [27] También se realizaron ensayos in vitro y otras pruebas para validar la idea de la aparición de una respuesta inmunitaria real para respaldar lo que observaron en los ratones. [27] Por ejemplo, se aisló el bazo de los ratones infectados y se midió la presencia de citocinas y grupos de células inmunitarias activadas específicamente que indicarían que se produjo una respuesta inmunitaria específica tras la vacunación. Los CTL aislados específicos para la proteína survivina después de la vacunación de los ratones se utilizaron en ensayos de citotoxicidad en los que se demostró que las células tumorales de los ratones que expresaban survivina morían tras la incubación con los CTL específicos. [27]
Mediante el uso de una vacuna de ADN oral transportada en una forma atenuada no virulenta de Salmonella typhimurium, que co-codificaba la quimiocina secretora CCL21 y la proteína survivina en ratones C57BL/6J, Xiang et al. han podido provocar una respuesta inmune llevada a cabo por células dendríticas (CD) y CTL para eliminar y suprimir las metástasis pulmonares del carcinoma de pulmón de células no pequeñas. La activación de la respuesta inmune probablemente se esté produciendo en el órgano linfoide secundario llamado placa de Peyer en el intestino delgado, donde las CD captan la proteína survivina por fagocitosis y la presentan en sus receptores de superficie a las células T CD8+ vírgenes (CTL no inactivados) para lograr una respuesta inmune específica dirigida exclusivamente a la survivina. [27] Los CTL activados específicos para un antígeno en particular matan a sus células diana reconociendo primero partes de la proteína survivina expresada en las proteínas MHC I (inmunohistocompatibilidad) presentes en la superficie de las células tumorales y la vasculatura y luego liberando gránulos que inducen a las células tumorales a sufrir apoptosis. La vacuna de ADN contenía la quimiocina secretora CCL21 como una forma de aumentar la probabilidad de provocar la respuesta inmunitaria al mediar mejor la interacción física de las células dendríticas que presentan antígenos y las células T CD8+ vírgenes, lo que resulta en una mayor probabilidad de activación inmunitaria. [27]
Fulda et al. han demostrado que el compuesto natural resveratrol (un polifenol que se encuentra en las uvas y el vino tinto) puede utilizarse como sensibilizador de la apoptosis inducida por fármacos anticancerígenos mediante la acción de provocar la detención del ciclo celular. [28] Esta detención del ciclo celular provoca una disminución drástica de los niveles de survivina en las células, ya que se sabe por la literatura que la expresión de survivina está muy relacionada con el estado de la fase del ciclo celular. Por tanto, la disminución de survivina, que es un factor que contribuye a la resistencia a la quimioterapia y a las terapias de inducción de la apoptosis, haría que las células cancerosas fueran más propensas a dichos tratamientos contra el cáncer. Fulda et al. han demostrado los beneficios del resveratrol mediante una serie de experimentos. En primer lugar, los autores del artículo probaron los efectos citotóxicos intrínsecos del resveratrol. Descubrieron que inducía niveles moderados de apoptosis solo en células de neuroblastoma SHEP. [28] Después, probaron el resveratrol en combinación con varios agentes anticancerígenos conocidos. Encontraron un aumento constante en el nivel de apoptosis inducida por los fármacos cuando el resveratrol también estaba presente. [28] Además, variaron el orden en el que se introdujeron los fármacos o el resveratrol en las células cancerosas para determinar si la secuencia del tratamiento tenía algún efecto importante. Se encontró que los niveles más altos de inducción de apoptosis se observaron cuando se añadió resveratrol antes del tratamiento con fármacos contra el cáncer. [28] A continuación, los autores probaron si había alguna sensibilidad diferencial a la apoptosis relacionada con la fase del ciclo celular en la que se encontraban las células. El análisis por citometría de flujo reveló una acumulación de células en fase S tras el tratamiento con resveratrol. Las células también se detuvieron en diferentes fases del ciclo celular utilizando compuestos especiales y luego se trataron con los fármacos contra el cáncer. Encontraron que las células detenidas en la fase S eran significativamente más sensibles a los efectos citotóxicos de los fármacos. [28]
Para determinar la participación de la survivina en la sensibilización mediada por resveratrol, los autores decidieron probar si la regulación negativa de la expresión de la proteína survivina específica conferiría un efecto similar en el fenotipo de las células tratadas con resveratrol. En términos de ver en qué nivel funcionaba el resveratrol, realizaron un Northern blot y descubrieron que el tratamiento con resveratrol resultó en una disminución en los niveles de ARNm de survivina, [28] lo que implica la acción inhibidora del resveratrol a nivel transcripcional. Para ver más a fondo si la survivina desempeñaba un papel clave en la sensibilización de las células cancerosas a los fármacos citotóxicos, se utilizaron oligonucleótidos antisentido de survivina para inhibir cualquier ARNm de survivina y, por lo tanto, también se elimina su posibilidad de ser traducida. Los ARNi para survivina son complementos en secuencia a la secuencia de ARNm que codifica survivina. Cuando estos ARNi para survivina se introducen en las células, se unirán al ARNm complementario respectivo y, por lo tanto, evitarán su traducción, ya que el ARNm ahora no puede interactuar físicamente de manera adecuada con la maquinaria de traducción. De esta manera, los ARNi para survivina regulan de manera efectiva el nivel de expresión de survivina en la célula. Las células tratadas con oligonucleótidos antisentido para survivina mostraron una sensibilización similar a los fármacos citotóxicos que las células tratadas con resveratrol, lo que respalda el mecanismo de acción del resveratrol. [28]
Se ha observado que el desarrollo de resistencia hormonal en el cáncer de próstata puede deberse a la regulación positiva de genes antiapoptóticos, uno de los cuales es la survivina. [29]
Zhang et al. plantean la hipótesis de que, si la survivina contribuye significativamente al desarrollo de la resistencia a la terapia hormonal en las células del cáncer de próstata, la focalización de la survivina y su bloqueo mejoraría la susceptibilidad de las células del cáncer de próstata a la terapia antiandrogénica. (La terapia antiandrogénica utiliza fármacos para eliminar la presencia de andrógenos en la célula y el entorno celular, ya que se sabe que dichos andrógenos mejoran la inmortalidad del tumor en las células del cáncer de próstata). Zhang et al. evaluaron por primera vez el nivel de expresión de survivina de LNCaP (una línea celular de cáncer de próstata dependiente de andrógenos que expresa receptores de andrógenos intactos) utilizando un análisis Western cuantitativo y encontraron una alta expresión de survivina en estas células. [29] Las células expuestas a dihidrotestosterona (DHT) mostraron niveles aumentados de expresión de survivina solamente y no de otros miembros de la familia IAP. [29] Este resultado sugiere que los andrógenos pueden regular positivamente la survivina, lo que contribuye a la resistencia a la apoptosis observada en las células tumorales. [29] A continuación, con la adición de flutamida (un antiandrógeno) a las células, se observó que los niveles de survivina disminuyeron significativamente. [29] Las células LNCaP se transdujeron por separado con las diferentes construcciones del gen de survivina (mutante o de tipo salvaje) y se sometieron al tratamiento con flutamida y se evaluó el nivel de apoptosis. Se demostró que las células transducidas con mutantes de survivina tratadas con flutamida aumentaron significativamente la apoptosis al doble que el tratamiento con flutamida sola. [29] Por otro lado, se encontró que la sobreexpresión de la survivina de tipo salvaje reducía significativamente los niveles de apoptosis del tratamiento con flutamida en comparación con el tratamiento con flutamida sola. [29] Por lo tanto, estos resultados respaldan la hipótesis de que la survivina desempeña un papel en la naturaleza antiapoptótica de la línea celular de cáncer LNCaP y que la inhibición de la survivina en las células de cáncer de próstata parece mejorar el efecto terapéutico de la flutamida.
Se ha demostrado que survivin interactúa con: