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Secuenciación de microARN

La secuenciación de microARN (miRNA-seq) , un tipo de RNA-Seq , es el uso de secuenciación de próxima generación o secuenciación de ADN masiva y paralela de alto rendimiento para secuenciar microARN , también llamados miARN. miRNA-seq se diferencia de otras formas de RNA-seq en que el material de entrada a menudo se enriquece con ARN pequeños. miRNA-seq permite a los investigadores examinar patrones de expresión específicos de tejido, asociaciones de enfermedades e isoformas de miARN, y descubrir miARN no caracterizados previamente. La evidencia de que los miARN desregulados desempeñan un papel en enfermedades como el cáncer [1] ha posicionado a miRNA-seq para convertirse potencialmente en una herramienta importante en el futuro para diagnósticos y pronósticos a medida que los costos continúan disminuyendo. [2] Al igual que otras tecnologías de perfilado de miARN, miRNA-Seq tiene ventajas (independencia de secuencia, cobertura) y desventajas (alto costo, requisitos de infraestructura, duración de ejecución y posibles artefactos ). [3]

Introducción

Los microARN (miARN) son una familia de ácidos ribonucleicos pequeños, de 21 a 25 nucleótidos de longitud, que modulan la expresión de proteínas a través de la degradación de la transcripción, la inhibición de la traducción o el secuestro de transcripciones. [4] [5] [6] El primer miARN descubierto, lin-4 , se encontró en una prueba de mutagénesis genética para identificar elementos moleculares que controlan el desarrollo postembrionario del nematodo Caenorhabditis elegans . [7] El gen lin-4 codificó un ARN de 22 nucleótidos con sitios de unión complementarios conservados en la región 3' no traducida de la transcripción del ARNm lin-14 [8] y reguló negativamente la expresión de la proteína LIN-14. [9] Ahora se piensa que los miRNA están involucrados en la regulación de muchos procesos biológicos y de desarrollo, incluyendo la hematopoyesis ( miR-181 en Mus musculus [10] ), el metabolismo lipídico ( miR-14 en Drosophila melanogaster [11] ) y el desarrollo neuronal ( lsy-6 en Caenorhabditis elegans [12] ). [6] Estos descubrimientos requirieron el desarrollo de técnicas capaces de identificar y caracterizar los miRNA, como miRNA-seq.

Historia

La secuenciación de microARN (miRNA-seq) se desarrolló para aprovechar la secuenciación de próxima generación o las tecnologías de secuenciación masiva paralela de alto rendimiento para encontrar nuevos miRNA y sus perfiles de expresión en una muestra dada. La secuenciación de miRNA en sí misma no es una idea nueva, los métodos iniciales de secuenciación utilizaban métodos de secuenciación de Sanger . La preparación de la secuenciación implicaba la creación de bibliotecas mediante la clonación de ADN transcrito de forma inversa a partir de pequeños ARN endógenos de tamaño de 21-25 pb seleccionados por electroforesis en columna y gel . [13] Sin embargo, este método es exhaustivo en términos de tiempo y recursos, ya que cada clon debe amplificarse y prepararse individualmente para la secuenciación. Este método también favorece inadvertidamente a los miRNA que se expresan altamente. [6] La secuenciación de próxima generación elimina la necesidad de sondas de hibridación específicas de secuencia requeridas en el análisis de microarrays de ADN , así como los laboriosos métodos de clonación requeridos en el método de secuenciación de Sanger. Además, las plataformas de secuenciación de próxima generación en el método miRNA-SEQ facilitan la secuenciación de grandes grupos de ARN pequeños en una única ejecución de secuenciación. [14]

La secuenciación de miRNA se puede realizar utilizando una variedad de plataformas de secuenciación. El primer análisis de ARN pequeños utilizando métodos de secuenciación de miRNA examinó aproximadamente 1,4 millones de ARN pequeños de la planta modelo Arabidopsis thaliana utilizando la plataforma de secuenciación Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS) de Lynx Therapeutics. Este estudio demostró el potencial de las nuevas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento para el estudio de ARN pequeños, y mostró que los genomas generan grandes cantidades de ARN pequeños y las plantas son fuentes particularmente ricas de ARN pequeños. [15] Estudios posteriores utilizaron otras tecnologías de secuenciación, como un estudio en C. elegans que identificó 18 nuevos genes de miRNA, así como una nueva clase de ARN pequeños de nematodos denominados 21U-RNA . [16] Otro estudio que compara los perfiles de ARN pequeños de tumores cervicales humanos y tejido normal utilizó el analizador de genoma de Illumina (empresa) para identificar 64 genes de miRNA humanos nuevos, así como 67 miRNA expresados ​​de manera diferencial. [17] La ​​plataforma de secuenciación SOLiD de Applied Biosystems también se ha utilizado para examinar el valor pronóstico de los miRNA en la detección del cáncer de mama humano. [ 18 ]

Métodos

Preparación de la biblioteca de miRNA

Preparación de ARN pequeño

La construcción de una biblioteca de secuencias se puede realizar utilizando una variedad de kits diferentes según la plataforma de secuenciación de alto rendimiento que se emplee. Sin embargo, existen varios pasos comunes para la preparación de la secuenciación de ARN pequeño. [19] [20]

Aislamiento total de ARN

En una muestra dada, todo el ARN se extrae y se aísla utilizando un método de isotiocianato/fenol/cloroformo (GITC/fenol) o un producto comercial como el reactivo Trizol ( Invitrogen ). Por lo general, se requiere una cantidad inicial de 50-100 μg de ARN total, 1 g de tejido generalmente produce 1 mg de ARN total, para la purificación en gel y la selección del tamaño. [20] También se mide el control de calidad del ARN, por ejemplo, ejecutando un chip de ARN en Caliper LabChipGX ( Caliper Life Sciences ).

Fraccionamiento por tamaño de ARN pequeños mediante electroforesis en gel

El ARN aislado se procesa en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. Se utiliza un método de obtención de imágenes, como oligonucleótidos marcados con 5'-32P radiactivos, junto con una escala de tamaño, para identificar una sección del gel que contiene ARN del tamaño adecuado, lo que reduce la cantidad de material que finalmente se secuencia. Este paso no tiene que realizarse necesariamente antes de los pasos de ligadura y transcripción inversa que se describen a continuación. [19] [20]

Ligadura

El paso de ligación añade adaptadores de ADN a ambos extremos de los ARN pequeños, que actúan como sitios de unión de cebadores durante la transcripción inversa y la amplificación por PCR . Un adaptador 3' de ADN monocatenario adenilado seguido de un adaptador 5' se liga a los ARN pequeños utilizando una enzima de ligación como la ARN ligasa T42. Los adaptadores también están diseñados para capturar ARN pequeños con un grupo fosfato 5', microARN característicos, en lugar de productos de degradación de ARN con un grupo hidroxilo 5'. [19] [20]

Transcripción inversa y amplificación por PCR

Este paso convierte los ARN ligados a adaptadores pequeños en clones de ADNc que se utilizan en la reacción de secuenciación. Hay muchos kits comerciales disponibles que llevarán a cabo este paso utilizando alguna forma de transcriptasa inversa . Luego se lleva a cabo la PCR para amplificar el conjunto de secuencias de ADNc. Los cebadores diseñados con etiquetas de nucleótidos únicas también se pueden utilizar en este paso para crear etiquetas de identificación en la secuenciación multiplex de bibliotecas agrupadas. [19] [20]

Secuenciación

La secuenciación real del ARN varía significativamente según la plataforma utilizada. Tres plataformas comunes de secuenciación de próxima generación [21] son ​​la pirosecuenciación en la plataforma 454 Life Sciences , [22] la secuenciación por síntesis basada en polimerasa en la plataforma Illumina (de la empresa) , [23] o la secuenciación por ligación en la plataforma ABI Solid Sequencing . [24]

Análisis de datos

Un aspecto central del análisis de datos de miRNA-seq es la capacidad de 1) obtener niveles de abundancia de miRNA a partir de lecturas de secuencias, 2) descubrir nuevos miRNA y luego poder 3) determinar los miRNA expresados ​​diferencialmente y sus 4) genes ARNm asociados como dianas.

Análisis de datos de miRNA-seq

Alineación y cuantificación de abundancia de miRNA

Los miRNA pueden expresarse preferentemente en ciertos tipos de células, tejidos, etapas de desarrollo o en estados patológicos particulares como el cáncer. [1] Dado que la secuenciación profunda (miRNA-seq) genera millones de lecturas a partir de una muestra dada, nos permite perfilar los miRNA; ya sea cuantificando su abundancia absoluta o descubriendo sus variantes (conocidas como isomiros [25] ). Tenga en cuenta que, dado que la longitud promedio de las lecturas de secuencia es más larga que el miRNA promedio (17-25 nt), los extremos 3' y 5' del miRNA deberían encontrarse en la misma lectura. Existen varios algoritmos de cuantificación de la abundancia de miRNA. [21] [26] Sus pasos generales son los siguientes: [27]

  1. Después de la secuenciación, las lecturas de secuencias sin procesar se filtran en función de la calidad. Las secuencias adaptadoras también se eliminan de las lecturas de secuencias sin procesar.
  2. Luego, las lecturas resultantes se formatean en un archivo fasta donde se registra el número de copia y la secuencia para cada etiqueta única.
  3. Las secuencias que pueden representar contaminación por E. Coli se identifican mediante una búsqueda BLAST en una base de datos de E. Coli y se eliminan del análisis.
  4. Cada una de las secuencias restantes se alinea con una base de datos de secuencias de miRNA (como miRBase [28] ). Para tener en cuenta el procesamiento imperfecto de DICER, se permite un saliente de 6 nt en el extremo 3' y 3 nt en el extremo 5'.
  5. Las lecturas que no se alinean con la base de datos de miRNA se alinean luego de manera flexible con los precursores de miRNA para detectar miRNA que podrían tener mutaciones o aquellos que han pasado por la edición de ARN .
  6. Luego, los recuentos de lectura de cada miRNA se normalizan al número total de miRNA mapeados para informar la abundancia de cada miRNA.

Descubrimiento de un nuevo miRNA

Otra ventaja de la secuenciación de miRNA es que permite descubrir nuevos miRNA que podrían haber eludido los métodos tradicionales de detección y elaboración de perfiles. [27] Existen varios algoritmos de descubrimiento de miRNA nuevos. Sus pasos generales son los siguientes:

  1. Obtenga lecturas que no se alinearon con secuencias de miRNA conocidas y asigne una correspondencia al genoma.
  2. Método de plegamiento del ARN
    1. Para las secuencias de miRNA en las que se encuentra una coincidencia exacta, obtenga la secuencia genómica incluyendo ~100 pb de secuencia flanqueante en cada lado y ejecute el ARN a través de un software de plegamiento de ARN como el paquete Vienna. [29]
    2. Las secuencias plegadas que se encuentran en un brazo de la horquilla de miRNA y tienen una energía libre mínima de menos de ~25 kcal/mol se seleccionan como posibles miRNA.
    3. Las secuencias preseleccionadas se recortan para incluir solo la posible secuencia precursora y luego se vuelven a plegar para garantizar que el precursor no haya sido estabilizado artificialmente por secuencias vecinas.
    4. Las secuencias plegadas resultantes se consideran miRNA nuevos si la secuencia de miRNA cae dentro de un brazo de la horquilla y están altamente conservadas entre especies.
  3. Método de expresión de hebras estelares (miRdeep [30] )
    1. Las nuevas secuencias de miRNA se identifican basándose en el patrón de expresión característico que muestran debido al procesamiento DICER: mayor expresión del miRNA maduro sobre la cadena en estrella y las secuencias de bucle.

Análisis de expresión diferencial

Una vez cuantificada la abundancia de microARN en cada muestra, se pueden comparar sus niveles de expresión entre muestras. De esta forma, se podrán identificar los microARN que se expresan preferentemente en determinados puntos temporales, o en determinados tejidos o estados patológicos. Después de normalizar la cantidad de lecturas mapeadas entre muestras, se pueden utilizar una serie de pruebas estadísticas (como las que se utilizan en el perfil de expresión génica ) para determinar la expresión diferencial.

Predicción de objetivos

La identificación de los objetivos de ARNm de un miRNA proporcionará una comprensión de los genes o redes de genes cuya expresión regulan. [31] Las bases de datos públicas proporcionan predicciones de objetivos de miRNA. Pero para distinguir mejor las predicciones positivas verdaderas de las predicciones positivas falsas, los datos de miRNA-seq se pueden integrar a los datos de mRNA-seq para observar pares funcionales de miRNA:mRNA. RNA22, [32] TargetScan , [33] [34] [35] [36] [37] [38] miRanda, [39] y PicTar [40] son ​​programas diseñados para este propósito. Aquí se proporciona una lista de programas de predicción . Los pasos generales son:

  1. Determinar los pares de unión de miRNA:mRNA, se identifica la complementariedad entre las secuencias de miRNA en el 3'-UTR de la secuencia de mRNA.
  2. Determinar el grado de conservación de los pares de unión miRNA:mRNA entre especies. Normalmente, los pares con mayor nivel de unión tienen menos probabilidades de ser falsos positivos de predicción.
  3. Observe si hay evidencia de orientación de miRNA en los datos de expresión de proteínas o de secuenciación de ARNm: cuando la expresión de miRNA es alta, la expresión de genes y proteínas de su gen objetivo debe ser baja.

Validación de objetivos para dianas de ARNm escindido

Muchos miRNA funcionan para dirigir la escisión de sus dianas de ARNm; esto es particularmente cierto en plantas, y por lo tanto se han desarrollado métodos de secuenciación de alto rendimiento para aprovechar esta propiedad de los miRNA mediante la secuenciación de los extremos 3' sin capuchón de los ARNm escindidos o degradados. Estos métodos se conocen como secuenciación de degradoma o PARE. [41] [42] La validación de la escisión del objetivo en ARNm específicos se realiza típicamente utilizando una versión modificada de la amplificación rápida de extremos de ADNc de 5' con un cebador específico del gen.

Aplicaciones

Identificación de nuevos miRNA

La secuenciación de miRNA ha revelado nuevos miRNA que antes se habían pasado por alto en los métodos tradicionales de elaboración de perfiles de miRNA. Algunos ejemplos de estos hallazgos son los encontrados en células madre embrionarias, [25] embriones de pollo, [43] leucemia linfoblástica aguda, [44] linfoma difuso de células B grandes y células B, [45] leucemia mieloide aguda, [46] y cáncer de pulmón. [47]

Biomarcadores de enfermedades

Los micro ARN son reguladores importantes de casi todos los procesos celulares, como la supervivencia, la proliferación y la diferenciación . En consecuencia, no es inesperado que los micro ARN estén involucrados en varios aspectos del cáncer a través de la regulación de la expresión de genes supresores de tumores y oncogénicos . En combinación con el desarrollo de métodos de elaboración de perfiles de alto rendimiento, los micro ARN se han identificado como biomarcadores para la clasificación del cáncer, la respuesta a la terapia y el pronóstico. [48] Además, debido a que los micro ARN regulan la expresión genética, también pueden revelar perturbaciones en redes reguladoras importantes que pueden estar impulsando un trastorno particular. [48] A continuación se detallan varias aplicaciones de los micro ARN como biomarcadores y predictores de enfermedades.

α Esta no es una lista completa de miRNA involucrados en estas neoplasias malignas.

Comparación con otros métodos de elaboración de perfiles de miRNA

Las desventajas de utilizar miRNA-seq sobre otros métodos de perfilado de miRNA son que es más costoso, generalmente requiere una mayor cantidad de ARN total, implica una amplificación extensa y requiere más tiempo que los métodos de microarray y qPCR. [3] Además, los métodos de preparación de bibliotecas de miRNA-seq parecen tener una representación preferencial sistemática del complemento de miRNA, y esto impide la determinación precisa de la abundancia de miRNA. [64] Al mismo tiempo, el enfoque es independiente de la hibridación y, por lo tanto, no requiere información de secuencia a priori . Debido a esto, se pueden obtener secuencias de nuevos miRNA e isoformas de miRNA (isoMirs), distinguir miRNA secuencialmente similares e identificar mutaciones puntuales. [65]

Comparación de plataformas de elaboración de perfiles de miRNA

[3]

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