La proteómica dirigida que utiliza SRM y métodos de adquisición independientes de los datos se consideran a menudo alternativas a la proteómica shotgun en el campo de la proteómica ascendente . Mientras que la proteómica shotgun utiliza la selección dependiente de los datos de iones precursores para generar escaneos de iones de fragmentos, los métodos antes mencionados utilizan un método determinista para la adquisición de escaneos de iones de fragmentos.
Historia
La proteómica de escopeta surgió de las dificultades de usar tecnologías anteriores para separar mezclas complejas. En 1975, O'Farrell y Klose describieron la electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional ( 2D-PAGE ) con la capacidad de resolver mezclas complejas de proteínas. [7] [8] El desarrollo de la ionización por desorción láser asistida por matriz ( MALDI ), la ionización por electrospray ( ESI ) y la búsqueda en bases de datos continuaron haciendo crecer el campo de la proteómica. Sin embargo, estos métodos aún tenían dificultades para identificar y separar proteínas de baja abundancia, proteínas aberrantes y proteínas de membrana. La proteómica de escopeta surgió como un método que podía resolver incluso estas proteínas. [5]
Ventajas
La proteómica de escopeta permite la identificación global de proteínas, así como la capacidad de perfilar sistemáticamente proteomas dinámicos. [9] También evita la modesta eficiencia de separación y la baja sensibilidad espectral de masas asociadas con el análisis de proteínas intactas. [1]
Desventajas
El filtrado de exclusión dinámica que se utiliza a menudo en la proteómica shotgun maximiza el número de proteínas identificadas a expensas del muestreo aleatorio. [10] Este problema puede verse exacerbado por el submuestreo inherente a la proteómica shotgun. [11]
Flujo de trabajo
Se cultivan células que contienen el complemento proteico deseado. A continuación, se extraen las proteínas de la mezcla y se digieren con una proteasa para producir una mezcla de péptidos. [9] A continuación, la mezcla de péptidos se carga directamente en una columna microcapilar y los péptidos se separan por hidrofobicidad y carga. A medida que los péptidos se eluyen de la columna, se ionizan y se separan por m/z en la primera etapa de la espectrometría de masas en tándem . Los iones seleccionados experimentan una disociación inducida por colisión u otro proceso para inducir la fragmentación. Los fragmentos cargados se separan en la segunda etapa de la espectrometría de masas en tándem.
La "huella digital" del espectro de masas de fragmentación de cada péptido se utiliza para identificar la proteína de la que derivan mediante una búsqueda en una base de datos de secuencias con un software disponible comercialmente (por ejemplo, Sequest o Mascot ). [9] Algunos ejemplos de bases de datos de secuencias son la base de datos Genpept o la base de datos PIR. [12] Después de la búsqueda en la base de datos, cada coincidencia de espectro de péptidos (PSM) debe evaluarse para determinar su validez. [13] Este análisis permite a los investigadores perfilar varios sistemas biológicos. [9]
Desafíos en la identificación de péptidos
Los péptidos degenerados (compartidos por dos o más proteínas en la base de datos) dificultan la identificación inequívoca de la proteína a la que pertenecen. Además, algunas muestras de proteoma de vertebrados tienen una gran cantidad de parálogos , y el empalme alternativo en eucariotas superiores puede dar como resultado muchas subsecuencias de proteínas idénticas. [1] Además, muchas proteínas se modifican de forma natural (co- o postraduccional) o artificial (artefactos de preparación de la muestra). Esto desafía aún más la identificación de la secuencia de péptidos mediante enfoques de coincidencia de bases de datos convencionales. Junto con los espectros de fragmentación de péptidos de mala calidad o alta complejidad (debido al coaislamiento o limitaciones de sensibilidad), esto deja en un experimento de proteómica shotgun convencional muchos espectros de secuenciación sin identificar. [14] [15] [16] [17]
Aplicaciones prácticas
Una vez secuenciado el genoma humano, el siguiente paso es la verificación y anotación funcional de todos los genes previstos y sus productos proteicos. [4] La proteómica shotgun se puede utilizar para la clasificación funcional o el análisis comparativo de estos productos proteicos. Se puede utilizar en proyectos que van desde el proteoma completo a gran escala hasta proyectos centrados en una sola familia de proteínas. Se puede realizar en laboratorios de investigación o de forma comercial.
Análisis a gran escala
Un ejemplo de esto es un estudio de Washburn, Wolters y Yates en el que utilizaron la proteómica shotgun en el proteoma de una cepa de Saccharomyces cerevisiae cultivada hasta la fase logarítmica media. Pudieron detectar e identificar 1.484 proteínas, así como identificar proteínas que rara vez se ven en el análisis del proteoma, incluidas proteínas de baja abundancia como factores de transcripción y proteínas quinasas . También pudieron identificar 131 proteínas con tres o más dominios transmembrana predichos . [2]
Familia de proteínas
Vaisar et al. utilizan la proteómica shotgun para implicar la inhibición de la proteasa y la activación del complemento en las propiedades antiinflamatorias de la lipoproteína de alta densidad . [18] En un estudio de Lee et al., se observó un mayor nivel de expresión de hnRNP A2/B1 y Hsp90 en las células de hepatoma humano HepG2 que en las células de tipo salvaje. Esto condujo a una búsqueda de roles funcionales informados mediados en conjunto por estas dos chaperonas celulares multifuncionales. [19]
^ abc Alves P, Arnold RJ, Novotny MV, Radivojac P, Reilly JP, Tang H (2007). "Avances en la inferencia de proteínas a partir de la proteómica de escopeta utilizando detectabilidad de péptidos". Simposio del Pacífico sobre Bioinformática. Simposio del Pacífico sobre Bioinformática : 409–20. PMID 17990506.
^ ab Washburn MP, Wolters D, Yates JR (marzo de 2001). "Análisis a gran escala del proteoma de la levadura mediante tecnología de identificación de proteínas multidimensional". Nature Biotechnology . 19 (3): 242–7. doi :10.1038/85686. PMID 11231557. S2CID 16796135.
^ Wolters DA, Washburn MP, Yates JR (diciembre de 2001). "Una tecnología de identificación de proteínas multidimensional automatizada para la proteómica de escopeta". Química analítica . 73 (23): 5683–90. doi :10.1021/ac010617e. PMID 11774908.
^ ab Hu L, Ye M, Jiang X, Feng S, Zou H (agosto de 2007). "Avances en técnicas analíticas con guiones para el análisis de proteomas y peptidomas shotgun: una revisión". Analytica Chimica Acta . 598 (2): 193–204. doi :10.1016/j.aca.2007.07.046. PMID 17719892.
^ ab Fournier ML, Gilmore JM, Martin-Brown SA, Washburn MP (agosto de 2007). "Proteómica shotgun basada en separaciones multidimensionales". Chemical Reviews . 107 (8): 3654–86. doi :10.1021/cr068279a. PMID 17649983.
^ Nesvizhskii AI (2007). "Identificación de proteínas mediante espectrometría de masas en tándem y búsqueda en bases de datos de secuencias". Análisis de datos de espectrometría de masas en proteómica . Métodos Mol. Biol. Vol. 367. págs. 87–119. doi :10.1385/1-59745-275-0:87. ISBN978-1-59745-275-5. Número de identificación personal 17185772.
^ O'Farrell PH (mayo de 1975). "Electroforesis bidimensional de proteínas de alta resolución". The Journal of Biological Chemistry . 250 (10): 4007–21. doi : 10.1016/S0021-9258(19)41496-8 . PMC 2874754 . PMID 236308.
^ Klose J (1975). "Mapeo de proteínas mediante la combinación de isoelectroenfoque y electroforesis de tejidos de ratón. Un nuevo enfoque para la prueba de mutaciones puntuales inducidas en mamíferos". Humangenetik . 26 (3): 231–43. doi :10.1007/bf00281458. PMID 1093965. S2CID 30981877.
^ abcd Wu CC, MacCoss MJ (junio de 2002). "Proteómica de escopeta: herramientas para el análisis de sistemas biológicos complejos". Current Opinion in Molecular Therapeutics . 4 (3): 242–50. PMID 12139310.
^ Zhang B, VerBerkmoes NC, Langston MA, Uberbacher E, Hettich RL, Samatova NF (noviembre de 2006). "Detección de la expresión proteica diferencial y correlacionada en la proteómica shotgun sin etiqueta". Journal of Proteome Research . 5 (11): 2909–18. doi :10.1021/pr0600273. PMID 17081042. S2CID 22254554.
^ Tolmachev AV, Monroe ME, Purvine SO, Moore RJ, Jaitly N, Adkins JN, et al. (noviembre de 2008). "Caracterización de estrategias para obtener identificaciones confiables en mediciones proteómicas de abajo hacia arriba utilizando instrumentos FTMS híbridos". Química analítica . 80 (22): 8514–25. doi :10.1021/ac801376g. PMC 2692492 . PMID 18855412.
^ Eng JK, McCormack AL, Yates JR (noviembre de 1994). "Un enfoque para correlacionar datos espectrales de masas en tándem de péptidos con secuencias de aminoácidos en una base de datos de proteínas". Journal of the American Society for Mass Spectrometry . 5 (11): 976–89. CiteSeerX 10.1.1.377.3188 . doi : 10.1016/1044-0305(94)80016-2 . PMID 24226387. S2CID 18413192.
^ Cerqueira FR, Ferreira RS, Oliveira AP, Gomes AP, Ramos HJ, Graber A, Baumgartner C (1 de enero de 2012). "MUMAL: análisis multivariado en proteómica shotgun utilizando técnicas de aprendizaje automático". BMC Genomics . 13 (Supl 5): S4. doi : 10.1186/1471-2164-13-S5-S4 . PMC 3477001 . PMID 23095859.
^ Griss J, Perez-Riverol Y, Lewis S, Tabb DL, Dianes JA, Del-Toro N, et al. (agosto de 2016). "Reconocimiento de millones de espectros no identificados de manera consistente en cientos de conjuntos de datos de proteómica de escopeta". Nature Methods . 13 (8): 651–656. doi :10.1038/nmeth.3902. PMC 4968634 . PMID 27493588.
^ den Ridder M, Daran-Lapujade P, Pabst M (febrero de 2020). "Proteómica de escopeta: por qué miles de señales no identificadas son importantes". FEMS Yeast Research . 20 (1). doi : 10.1093/femsyr/foz088 . PMID 31860055.
^ Michalski A, Cox J, Mann M (abril de 2011). "Más de 100.000 especies de péptidos detectables se eluyen en ejecuciones proteómicas de una sola escopeta, pero la mayoría es inaccesible a la LC-MS/MS dependiente de los datos". Journal of Proteome Research . 10 (4): 1785–93. doi :10.1021/pr101060v. PMID 21309581.
^ Devabhaktuni A, Lin S, Zhang L, Swaminathan K, Gonzalez CG, Olsson N, et al. (abril de 2019). "TagGraph revela vastos paisajes de modificación de proteínas a partir de grandes conjuntos de datos de espectrometría de masas en tándem". Nature Biotechnology . 37 (4): 469–479. doi :10.1038/s41587-019-0067-5. PMC 6447449 . PMID 30936560.
^ Vaisar T, Pennathur S, Green PS, Gharib SA, Hoofnagle AN, Cheung MC, et al. (marzo de 2007). "La proteómica shotgun implica la inhibición de la proteasa y la activación del complemento en las propiedades antiinflamatorias de HDL". The Journal of Clinical Investigation . 117 (3): 746–56. doi :10.1172/JCI26206. PMC 1804352 . PMID 17332893.
^ Lee CL, Hsiao HH, Lin CW, Wu SP, Huang SY, Wu CY, et al. (diciembre de 2003). "Enfoque proteómico estratégico de escopeta para la construcción eficiente de un mapa de expresión de familias de proteínas específicas en líneas celulares de hepatoma". Proteómica . 3 (12): 2472–86. doi : 10.1002/pmic.200300586 . PMID 14673797. S2CID 24518852.
Lectura adicional
Marcotte EM (julio de 2007). "¿Cómo identifican proteínas los algoritmos de proteómica shotgun?". Nature Biotechnology . 25 (7): 755–7. doi :10.1038/nbt0707-755. PMID 17621303. S2CID 14256080.
Veenstra, Timothy D.; Yates, John R. (2006). Proteómica para el descubrimiento biológico . Nueva York: Wiley-Liss. ISBN 978-0-471-16005-2.
Yates JR, Ruse CI, Nakorchevsky A (2009). "Proteómica por espectrometría de masas: enfoques, avances y aplicaciones". Revisión anual de ingeniería biomédica . 11 : 49–79. doi :10.1146/annurev-bioeng-061008-124934. PMID 19400705.
Liao L, McClatchy DB, Yates JR (julio de 2009). "Proteómica de escopeta en neurociencia". Neuron . 63 (1): 12–26. doi :10.1016/j.neuron.2009.06.011. PMC 2746002 . PMID 19607789.