El virus adenoasociado autocomplementario ( scAAV ) es un vector viral diseñado a partir del virus adenoasociado (AAV) natural para ser utilizado como una herramienta para la terapia génica . [1] El uso de AAV recombinante (rAAV) ha tenido éxito en ensayos clínicos que abordan una variedad de enfermedades. [2] Esta progenie de rAAV creada en laboratorio se denomina "autocomplementaria" porque la región codificante ha sido diseñada para formar una plantilla de ADN bicatenario intramolecular. Un paso limitante de la velocidad para el genoma estándar de AAV implica la síntesis de la segunda cadena, ya que el genoma típico de AAV es una plantilla de ADN monocatenario . [3] [4] Sin embargo, este no es el caso de los genomas scAAV. Tras la infección, en lugar de esperar la síntesis mediada por células de la segunda cadena, las dos mitades complementarias de scAAV se asociarán para formar una unidad de ADN bicatenario (dsDNA) que está lista para la replicación y transcripción inmediatas . La salvedad de esta construcción es que, en lugar de la capacidad de codificación completa que se encuentra en rAAV (4,7–6 kb ) [5], scAAV solo puede contener aproximadamente la mitad de esa cantidad (≈2,4 kb). [6]
En la aplicación de la terapia génica que utiliza rAAV, el virus transduce la célula con un ADN monocatenario (ssDNA) flanqueado por dos repeticiones terminales invertidas (ITR). Estas ITR forman horquillas al final de la secuencia que sirven como cebadores para iniciar la síntesis de la segunda cadena antes de que puedan comenzar los pasos posteriores de la infección . La síntesis de la segunda cadena se considera uno de los varios obstáculos para una infección eficiente. [7] Las ventajas adicionales del scAAV incluyen una expresión transgénica aumentada y prolongada in vitro e in vivo , así como "una mayor estabilidad del ADN in vivo y una circularización más eficaz". [8]
El scAAV es un vector atractivo para su uso en terapia génica por muchas razones. Su vector original, AAV, ya se está utilizando en ensayos clínicos. [9] Debido a la variedad de serotipos de scAAV disponibles, los científicos pueden elegir un serotipo que tenga propiedades deseables para su terapia. Seleccionar solo un subconjunto de células mejora la especificidad y reduce el riesgo de ser inhibido por el sistema inmunológico . Diferentes serotipos de scAAV y AAV pueden transfectar de manera eficiente una variedad de objetivos celulares. [10] [11] Como todos los enfoques basados en vectores para la terapia génica, un obstáculo para traducir las terapias de los ensayos preclínicos a una aplicación clínica humana será la producción de grandes cantidades de virus altamente concentrados. [12] Una desventaja que enfrenta el scAAV es que debido a la expresión génica robusta, los productos transgénicos administrados a través del scAAV provocan una respuesta inmune más fuerte que esos mismos transgenes administrados a través de un vector AAV monocatenario. [13]
Al igual que el AAV, el scAAV es un miembro de la familia Parvoviridae , comúnmente conocido como parvovirus . Estos virus son virus sin envoltura , de ADN monocatenario (ssDNA). Dentro de Parvoviridae, el scAAV pertenece además al género Dependovirus , que se caracteriza por su incapacidad para replicarse por sí solo. En la naturaleza, estos virus dependen de otro virus para proporcionar la maquinaria de replicación; el virus adenoasociado solo puede replicarse durante una infección activa de adenovirus o algunos tipos de herpesvirus . En el uso de laboratorio, este obstáculo se supera mediante la adición de plásmidos auxiliares , que expresan de forma exógena genes de replicación de los que carece el propio AAV. [14]
Como dependovirus, el scAAV permanece en estado latente dentro de la célula hasta que la célula experimenta ciertas condiciones permisivas. Estas pueden incluir la presencia de una infección por un virus auxiliar (como el adenovirus) u otros eventos tóxicos como la exposición a la luz ultravioleta o a carcinógenos . [14] Debido a que el ORF rep endógeno ha sido reemplazado por un transgén, los genes rep proporcionados exógenamente codifican las proteínas necesarias para la replicación del genoma y otros componentes del ciclo de vida viral. Los ITR ubicados en los extremos 5' y 3' del genoma viral sirven como origen de la replicación. [15]
Al igual que el ORF rep, el ORF cap del scAAV ha sido reemplazado por un transgén y, por lo tanto, se proporciona de forma exógena en un entorno de laboratorio. Los genes codificados en este ORF construyen proteínas de la cápside y son responsables (junto con el procesamiento intracelular) de transmitir la especificidad del objetivo. Las proteínas rep participan en la integración del genoma en las cápsides preformadas. [15] A pesar del hecho de que el scAAV está diseñado para formar dsADN tras la infección, las dos cadenas complementarias no están empaquetadas de manera bicatenaria. Los parvovirus empaquetan su genoma viral de tal manera que las bases del ssADN entran en contacto con los aminoácidos en el interior de la cápside viral. Por lo tanto, es probable que la secuencia del scAAV sea desenrollada por una helicasa de ADN codificada por el virus antes de ser empaquetada en la cápside de proteína viral. [7]