La quimioproteómica (también conocida como proteómica química ) implica una amplia gama de técnicas utilizadas para identificar e interrogar las interacciones proteína - molécula pequeña . [1] La quimioproteómica complementa el descubrimiento de fármacos fenotípicos , un paradigma que tiene como objetivo descubrir compuestos líderes sobre la base de aliviar un fenotipo de enfermedad , a diferencia del descubrimiento de fármacos basado en objetivos (farmacología inversa) , en el que los compuestos líderes están diseñados para interactuar con objetivos biológicos predeterminados que impulsan la enfermedad . [2] Como los ensayos de descubrimiento de fármacos fenotípicos no proporcionan confirmación del mecanismo de acción de un compuesto , la quimioproteómica proporciona valiosas estrategias de seguimiento para limitar los objetivos potenciales y, finalmente, validar el mecanismo de acción de una molécula . [2] La quimioproteómica también intenta abordar el desafío inherente de la promiscuidad de los fármacos en el descubrimiento de fármacos de moléculas pequeñas mediante el análisis de las interacciones proteína-molécula pequeña a escala del proteoma . Un objetivo importante de la quimioproteómica es caracterizar el interactoma de los fármacos candidatos para comprender mejor los mecanismos de toxicidad fuera del objetivo y la polifarmacología . [3]
Los ensayos de quimioproteómica se pueden estratificar en tres tipos básicos. Los enfoques basados en solución implican el uso de análogos de fármacos que modifican químicamente las proteínas objetivo en solución , etiquetándolas para su identificación. Los enfoques basados en inmovilización buscan aislar objetivos o ligandos potenciales anclando sus socios de unión a un soporte inmóvil. Los enfoques sin derivatización tienen como objetivo inferir interacciones fármaco -objetivo observando cambios en la estabilidad de la proteína o la cromatografía del fármaco tras la unión. Las técnicas computacionales complementan el conjunto de herramientas quimioproteómicas como líneas paralelas de evidencia que respaldan pares potenciales fármaco -objetivo, y se utilizan para generar modelos estructurales que informan la optimización principal . Se han identificado varios objetivos de fármacos de alto perfil utilizando quimioproteómica, y la mejora continua de la sensibilidad del espectrómetro de masas y la tecnología de sonda química indica que la quimioproteómica desempeñará un papel importante en el descubrimiento de fármacos futuros .
La conclusión del Proyecto Genoma Humano fue seguida con la esperanza de un nuevo paradigma en el tratamiento de enfermedades. Muchas enfermedades fatales e intratables pudieron mapearse a genes específicos , proporcionando un punto de partida para comprender mejor los roles de sus productos proteicos en la enfermedad. El descubrimiento de fármacos ha hecho uso de modelos de knock-out animales que resaltan el impacto de la ausencia de una proteína , particularmente en el desarrollo de la enfermedad, y los químicos medicinales han aprovechado la química computacional para generar compuestos de alta afinidad contra las proteínas causantes de enfermedades. [3] Sin embargo, las tasas de aprobación de fármacos de la FDA han estado en declive durante la última década. [4] Una fuente potencial de fracaso de los fármacos es la desconexión entre el descubrimiento temprano y tardío de fármacos . [3] El descubrimiento temprano de fármacos se centra en la validación genética de un objetivo, que es un fuerte predictor de éxito, pero los sistemas de knock-out y sobreexpresión son simplistas. Los sistemas de knock-out / knock-in condicionales espacial y temporalmente han mejorado el nivel de matices en el análisis in vivo de la función de las proteínas , pero aún no logran igualar completamente la amplitud sistémica de la acción farmacológica. [3] Por ejemplo, los medicamentos a menudo actúan a través de múltiples mecanismos y, a menudo, funcionan mejor al interactuar parcialmente con los objetivos . [3] Las herramientas quimioproteómicas ofrecen una solución para cerrar la brecha entre una comprensión genética de la enfermedad y una comprensión farmacológica de la acción de los medicamentos al identificar las muchas proteínas involucradas en el éxito terapéutico.
El conjunto de herramientas quimioproteómicas se basa en la proteómica cuantitativa basada en cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS o LC-MS) , que permite la identificación casi completa y la cuantificación relativa de proteomas complejos en muestras biológicas. [5] Además del análisis proteómico , también es posible la detección de modificaciones postraduccionales , como la fosforilación , la glicosilación , la acetilación y, recientemente, la ubiquitinación , que brindan información sobre el estado funcional de una célula. [5] La gran mayoría de los estudios proteómicos se analizan utilizando espectrómetros de masas orbitrap de alta resolución y las muestras se procesan utilizando un flujo de trabajo generalizable. Un procedimiento estándar comienza con la lisis de la muestra , en la que las proteínas se extraen en un tampón desnaturalizante que contiene sales , un agente que reduce los enlaces disulfuro , como el ditiotreitol , y un agente alquilante que recubre los grupos tiol , como la yodoacetamida . Las proteínas desnaturalizadas se proteolizan , a menudo con tripsina , y luego se separan de otros componentes de la mezcla antes del análisis mediante LC-MS/MS . Para una cuantificación más precisa, se pueden hacer reaccionar diferentes muestras con etiquetas de masa en tándem isobáricas (TMT), una forma de código de barras químico que permite la multiplexación de muestras , y luego agruparlas. [5]
La elaboración de perfiles proteómicos y transcriptómicos amplios ha dado lugar a innumerables avances en el ámbito biomédico, pero la caracterización de la expresión de ARN y proteínas tiene una capacidad limitada para informar sobre las características funcionales de las proteínas . Dado que la información sobre la transcripción y la expresión de proteínas deja lagunas en el conocimiento sobre los efectos de las modificaciones postraduccionales y las interacciones proteína-proteína en la actividad enzimática , y que la actividad enzimática varía según los tipos de células , los estados de enfermedad y las condiciones fisiológicas , se requieren herramientas especializadas para elaborar perfiles de la actividad enzimática en distintos contextos. [6] Además, muchas enzimas identificadas no se han caracterizado lo suficiente como para producir mecanismos procesables en los que basar los ensayos funcionales. Sin una base para una lectura bioquímica funcional , se requieren herramientas químicas para detectar interacciones fármaco-proteína.
El perfil de proteínas basado en la actividad ( ABPP , también proteómica basada en la actividad ) es una técnica que se desarrolló para monitorear la disponibilidad de sitios activos enzimáticos para sus ligandos endógenos . [5] ABPP utiliza sondas especialmente diseñadas que ingresan y forman un enlace covalente con el sitio activo de una enzima, lo que confirma que la enzima está en un estado activo. [7] La sonda suele ser un análogo del fármaco cuyo mecanismo se está estudiando, por lo que el etiquetado covalente de una enzima es indicativo de la unión del fármaco. Las sondas ABPP están diseñadas con tres unidades funcionales clave: (1) una ojiva covalente dirigida al sitio (grupo reactivo); (2) una etiqueta reportera, como biotina o rodamina ; y (3) un grupo enlazador. [8] La ojiva covalente dirigida al sitio, también llamada modificador covalente, es un electrófilo que modifica covalentemente un residuo de serina , cisteína o lisina en el sitio activo de la enzima y previene futuras interacciones con otros ligandos. [7] Las sondas ABPP generalmente están diseñadas contra clases enzimáticas y, por lo tanto, pueden proporcionar información a nivel de sistemas sobre el impacto del estado celular en las redes enzimáticas. La etiqueta del reportero se utiliza para confirmar el etiquetado de la enzima con el grupo reactivo y puede variar según la lectura posterior. Los reporteros más utilizados son las fracciones fluorescentes que permiten la obtención de imágenes y las etiquetas de afinidad , como la biotina, que permiten la extracción de enzimas marcadas y el análisis mediante espectrometría de masas . Existen desventajas para cada estrategia, a saber, que los reporteros fluorescentes no permiten el enriquecimiento para el análisis proteómico, mientras que las etiquetas de afinidad basadas en biotina copurifican con proteínas biotiniladas endógenamente . [8] Se utiliza un grupo enlazador para conectar el grupo reactivo al reportero, idealmente de una manera que no altere la actividad de la sonda. Los grupos enlazadores más comunes son las cadenas de alquilo largas , los PEG derivatizados y los polipéptidos modificados . [5]
Suponiendo que las enzimas varían en su estructura, función y asociaciones dependiendo del estado fisiológico o de desarrollo de un sistema, se puede inferir que la accesibilidad del sitio activo de una enzima también variará. [6] Por lo tanto, la capacidad de una sonda ABPP para marcar una enzima también variará según las condiciones. Por lo tanto, la unión de una sonda puede revelar información sobre las características funcionales de una enzima en diferentes contextos. La detección de alto rendimiento se ha beneficiado de la ABPP, particularmente en el área de ensayos de inhibición competitiva , en los que las muestras biológicas se preincuban con candidatos a fármacos y luego se hacen competir con las sondas ABPP para unirse a las enzimas objetivo. Los compuestos con alta afinidad con sus objetivos evitarán la unión de la sonda, y el grado de unión de la sonda se puede utilizar como una indicación de la afinidad del compuesto. Debido a que las sondas ABPP marcan clases de enzimas, este enfoque también se puede utilizar para perfilar la selectividad de los fármacos, ya que los compuestos altamente selectivos idealmente superarán a las sondas en solo un pequeño número de proteínas. [8]
A diferencia de la ABPP, que produce el etiquetado de proteínas tras la unión de la sonda, las sondas de etiquetado por fotoafinidad requieren activación por fotólisis antes de que se produzca la unión covalente a una proteína. [7] La presencia de un grupo fotorreactivo lo hace posible. [7] Estas sondas se componen de tres fracciones conectadas : (1) un andamiaje del fármaco; (2) un grupo fotorreactivo , como una fenilazida , fenildiazirina o benzofenona ; y (3) una etiqueta de identificación, como biotina, un colorante fluorescente o un controlador de química de clic . [9] El andamiaje del fármaco suele ser un análogo de un fármaco cuyo mecanismo se está estudiando y, lo que es más importante, se une al objetivo de forma reversible , lo que imita mejor la interacción entre la mayoría de los fármacos y sus objetivos. [9] Existen varias variedades de grupos fotorreactivos, pero son fundamentalmente diferentes de las sondas ABPP: mientras que ABPP marca específicamente los aminoácidos nucleofílicos en el sitio activo de un objetivo, el etiquetado por fotoafinidad no es específico y, por lo tanto, es aplicable al etiquetado de una gama más amplia de objetivos. [7] La etiqueta de identificación variará según el tipo de análisis que se esté realizando: los identificadores de biotina y química de clic son adecuados para el enriquecimiento de proteínas marcadas antes de la identificación basada en espectrometría de masas , mientras que los colorantes fluorescentes se utilizan cuando se utiliza un método de obtención de imágenes basado en gel , como SDS-PAGE , para validar la interacción con un objetivo. [7] [9]
Debido a que las sondas de fotoafinidad son multifuncionales, son difíciles de diseñar. Los químicos incorporan los mismos principios de modelado de la relación estructura-actividad en las sondas de fotoafinidad que se aplican a los fármacos, pero deben hacerlo sin comprometer la actividad del armazón del fármaco o la capacidad del grupo fotorreactivo para unirse. [9] Dado que los grupos fotorreactivos se unen indiscriminadamente, un diseño inadecuado puede hacer que la sonda se etiquete a sí misma o a proteínas no objetivo. La sonda debe permanecer estable en el almacenamiento, en diferentes tampones , a varios niveles de pH y en sistemas vivos para garantizar que el etiquetado se produzca solo cuando se exponga a la luz. La activación por luz también debe ajustarse con precisión, ya que la radiación puede dañar las células. [9]
Las técnicas quimioproteómicas basadas en inmovilización abarcan variaciones de la extracción por afinidad basada en microperlas , que es similar a la inmunoprecipitación , y la cromatografía de afinidad . En ambos casos, se utiliza un soporte sólido como superficie de inmovilización que lleva una molécula cebo. La molécula cebo puede ser un fármaco potencial si el investigador está tratando de identificar objetivos, o un objetivo, como una enzima inmovilizada , si el investigador está buscando moléculas pequeñas. [10] El cebo se expone a una mezcla de posibles socios de unión, que se pueden identificar después de eliminar los componentes no vinculantes.
La inmovilización basada en microperlas es una técnica modular que permite al investigador decidir si desea pescar objetivos proteicos del proteoma o compuestos similares a fármacos de bibliotecas químicas . Las propiedades macroscópicas de las microperlas las hacen aptas para aplicaciones de enriquecimiento de mano de obra relativamente baja, ya que son fáciles de visualizar y su masa a granel es fácilmente extraíble de las soluciones de proteínas. [11] Históricamente, las microperlas estaban hechas de polímeros inertes , como la agarosa y el dextrano , que se funcionalizan para unir un cebo de elección. En el caso de usar proteínas como cebo, los grupos funcionales de amina son enlaces comunes para facilitar la unión. Los enfoques más modernos se han beneficiado de la popularización de las dynabeads , un tipo de microperlas magnéticas , que permiten la separación magnética de analitos inmovilizados en perlas de las muestras tratadas. Las perlas magnéticas exhiben propiedades superparamagnéticas , que las hacen muy fáciles de eliminar de la solución usando un imán externo . [12] En un flujo de trabajo simplificado, se utilizan perlas magnéticas para inmovilizar un objetivo proteico , luego las perlas se mezclan con una biblioteca química para examinar posibles ligandos . Los ligandos de alta afinidad se unen al objetivo inmovilizado y resisten la eliminación mediante lavado, por lo que se enriquecen en la muestra. Por el contrario, un ligando de interés se puede inmovilizar y examinar contra proteínas del proteoma mediante incubación con un lisado . [12]
Se han aplicado estrategias híbridas basadas en solución e inmovilización, en las que se permite que los ligandos funcionalizados con una etiqueta de enriquecimiento, como la biotina, floten libremente en la solución y encuentren sus proteínas objetivo. Después de un período de incubación, los complejos de ligando-proteína se pueden hacer reaccionar con perlas recubiertas de estreptavidina , que se unen a la etiqueta de biotina y permiten la extracción e identificación de los socios de interacción. Esta tecnología se puede extender para ayudar con la preparación de muestras para ABPP y etiquetado de fotoafinidad . Si bien los enfoques de inmovilización han sido reproducibles y exitosos, es imposible evitar la limitación del impedimento estérico inducido por la inmovilización , que interfiere con el ajuste inducido . Otro inconveniente es la adsorción no específica de proteínas y moléculas pequeñas a la superficie de la perla, que tiene el potencial de generar falsos positivos. [10]
La cromatografía de afinidad surgió en la década de 1950 como un método poco utilizado para purificar enzimas; desde entonces se ha generalizado y es el más antiguo entre los enfoques quimioproteómicos. [13] La cromatografía de afinidad se realiza siguiendo uno de dos formatos básicos: inmovilización de ligando o inmovilización de diana. Bajo el formato de inmovilización de ligando, un ligando de interés (a menudo un fármaco principal) se inmoviliza dentro de una columna de cromatografía y actúa como fase estacionaria . Una muestra compleja que consta de muchas proteínas, como un lisado celular , se pasa a través de la columna y la diana de interés se une al ligando inmovilizado mientras que otros componentes de la muestra pasan a través de la columna sin retenerse. Bajo el formato de inmovilización de diana, una diana de interés (a menudo una proteína relevante para la enfermedad) se inmoviliza dentro de una columna de cromatografía y actúa como fase estacionaria . Las bibliotecas de compuestos agrupados se pasan luego a través de la columna en un tampón de aplicación , los ligandos se retienen a través de interacciones de unión con la fase estacionaria y otros compuestos pasan a través de la columna sin retenerse. [14] En ambos casos, los analitos retenidos se pueden eluir de la columna e identificar mediante espectrometría de masas. A continuación, se proporciona una tabla de estrategias de elución.
Si bien los enfoques anteriores han demostrado ser exitosos, están inherentemente limitados por su necesidad de derivatización , lo que pone en peligro la afinidad de la interacción que se dice que emulan los compuestos derivatizados e introduce un impedimento estérico . [10] Los ligandos y objetivos inmovilizados están limitados en su capacidad de moverse libremente a través del espacio de una manera que replique la interacción proteína-ligando nativa, y el cambio conformacional del ajuste inducido a menudo es limitado cuando se inmovilizan proteínas o fármacos. Los enfoques basados en sondas también alteran la naturaleza tridimensional de la interacción ligando-proteína al introducir grupos funcionales en el ligando, lo que puede alterar la actividad del compuesto. Los enfoques sin derivatización apuntan a inferir interacciones por proxy, a menudo a través de observaciones de cambios en la estabilidad de la proteína tras la unión, y a veces a través de coelución cromatográfica . [15]
Se cree que los métodos basados en la estabilidad a continuación funcionan debido a los cambios inducidos por ligando en las concentraciones de equilibrio de los estados conformacionales de las proteínas . Un solo tipo de proteína en solución puede estar representado por moléculas individuales en una variedad de conformaciones , muchas de ellas diferentes entre sí a pesar de ser idénticas en la secuencia de aminoácidos . Al unirse a un fármaco , la mayoría de la proteína unida al ligando entra en una conformación energéticamente favorable y se aleja de la distribución impredecible de los confórmeros menos estables. [16] Por lo tanto, se dice que la unión del ligando estabiliza las proteínas, haciéndolas resistentes a la degradación térmica , enzimática y química. A continuación, se presentan algunos ejemplos de enfoques libres de derivatización basados en la estabilidad.
El perfil térmico del proteoma (también conocido como ensayo de desplazamiento térmico celular ) es una estrategia popularizada recientemente para inferir interacciones entre ligando y proteína a partir de los cambios en la estabilidad térmica de la proteína inducidos por la unión del ligando. En una configuración de ensayo típica, las muestras que contienen proteínas se exponen a un ligando de elección, luego esas muestras se dividen en alícuotas y se calientan a puntos de temperatura individuales separados. Al unirse a un ligando, se espera que la estabilidad térmica de una proteína aumente, por lo que las proteínas unidas al ligando serán más resistentes a la desnaturalización térmica. Después del calentamiento, la cantidad de proteína no desnaturalizada restante se analiza utilizando proteómica cuantitativa y se generan curvas de estabilidad. Al compararla con una curva de estabilidad sin tratar, se espera que la curva tratada se desplace hacia la derecha, lo que indica que se produjo una estabilización inducida por el ligando. Históricamente, el perfil térmico del proteoma se ha evaluado utilizando un Western blot contra un objetivo de interés conocido. Con la llegada de los espectrómetros de masas Orbitrap de alta resolución , este tipo de experimento se puede ejecutar a escala de todo el proteoma y se pueden generar curvas de estabilidad para miles de proteínas a la vez. La elaboración de perfiles térmicos del proteoma se ha realizado con éxito in vitro , in situ e in vivo . Cuando se combina con la espectrometría de masas , esta técnica se conoce como ensayo de desplazamiento térmico celular por espectrometría de masas (MS- CETSA ) . [17]
El ensayo de estabilidad de la proteína en respuesta a la afinidad del fármaco sigue un supuesto básico similar al del TPP: que la estabilidad de la proteína aumenta con la unión del ligando. Sin embargo, en el DARTS, la estabilidad de la proteína se evalúa en respuesta a la digestión por una proteasa . Brevemente, se incuba una muestra de lisado celular con una pequeña molécula de interés, la muestra se divide en alícuotas y cada alícuota pasa por una proteólisis limitada después de la adición de la proteasa . La proteólisis limitada es fundamental, ya que la proteólisis completa haría que incluso una proteína unida al ligando se digiera por completo . Luego, las muestras se analizan mediante SDS-PAGE para evaluar las diferencias en el grado de digestión, y luego se cortan las bandas y se analizan mediante espectrometría de masas para confirmar las identidades de las proteínas que resisten la proteólisis . Alternativamente, si ya se sospecha del objetivo y se está probando para su validación, se puede utilizar un protocolo de transferencia Western para identificar la proteína directamente. [18]
La estabilidad de las proteínas a partir de las tasas de oxidación también se basa en el supuesto de que la unión del ligando confiere protección a las proteínas frente a las formas de degradación, esta vez de la oxidación de los residuos de metionina . En SPROX, un lisado se divide y se trata con un fármaco o un control DMSO, luego cada grupo se divide en alícuotas adicionales en muestras separadas con concentraciones crecientes del caótropo y el desnaturalizante clorhidrato de guanidinio (GuHCl). Dependiendo de la concentración de GuHCl , las proteínas se desdoblarán en distintos grados. Luego, cada muestra se hace reaccionar con peróxido de hidrógeno , que oxida los residuos de metionina . Las proteínas que se estabilizan con el fármaco permanecerán plegadas a concentraciones más altas de GuHCl y experimentarán una menor oxidación de metionina. Los residuos de metionina oxidados se pueden cuantificar mediante LC-MS/MS y se pueden utilizar para generar curvas de estabilidad de metionina, que son un indicador de la unión del fármaco. El ensayo SPROX tiene desventajas, a saber, que los únicos péptidos relevantes de las muestras SPROX son aquellos con residuos de metionina, que representan aproximadamente un tercio de los péptidos , y para los cuales actualmente no existen técnicas de enriquecimiento viables. Solo aquellas metioninas que están expuestas a la oxidación proporcionan información significativa, y no todas las diferencias en la oxidación de la metionina son consistentes con la estabilización de la proteína. Sin enriquecimiento, el análisis LC-MS/MS de estos péptidos es un desafío, ya que la contribución de otros componentes de la muestra al ruido del espectrómetro de masas puede ahogar la señal relevante. Por lo tanto, las muestras SPROX requieren fraccionamiento para concentrar los péptidos de interés antes del análisis LC-MS/MS . [16]
Si bien la adopción de la espectrometría de masas de selección por afinidad (AS-MS) ha llevado a una expansión de los formatos de ensayo, [19] la técnica general sigue un esquema simple. Los objetivos proteicos se incuban con moléculas pequeñas para permitir la formación de complejos estables de ligando - proteína , las moléculas pequeñas no unidas se eliminan de la mezcla y los componentes de los complejos de ligando - proteína restantes se analizan mediante espectrometría de masas . [19] Los ligandos unidos identificados se clasifican luego como hits y se pueden utilizar para proporcionar un punto de partida para la generación de líderes . Dado que la AS-MS mide la unión de manera imparcial, no es necesario vincular un hit a una lectura funcional, lo que abre la posibilidad de identificar fármacos que actúan más allá de los sitios activos, como moduladores alostéricos y chaperonas químicas , todo en un solo ensayo. [20] Debido a que las moléculas pequeñas se pueden identificar directamente por su masa exacta , no se necesita derivatización para confirmar la validez de un hit. [20] Entre los métodos de derivatización y sin etiquetas, la AS-MS tiene la ventaja única de ser adecuada para la evaluación de múltiples compuestos de prueba por experimento: se han informado hasta 20 000 compuestos por experimento en la literatura y un grupo ha informado sobre el análisis de bibliotecas químicas frente a grupos de proteínas heterogéneas . [20] Los pasos básicos de la AS-MS se describen con más detalle a continuación.
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Un flujo de trabajo de AS-MS generalizado comienza con la preincubación de soluciones de proteínas purificadas (es decir, proteínas objetivo ) con bibliotecas químicas en microplacas . Los ensayos pueden diseñarse para que contengan concentraciones de proteínas suficientemente altas para evitar la competencia por los sitios de unión entre análogos estructurales , lo que garantiza que se puedan identificar los resultados en un rango de afinidades; inversamente, los ensayos pueden contener bajas concentraciones de proteínas para permitir la distinción entre análogos de alta y baja afinidad e informar las relaciones estructura-actividad . [20] La elección de una biblioteca química es menos estricta que otras estrategias de detección de alto rendimiento debido a la falta de lecturas funcionales, que de otro modo requerirían la deconvolución del compuesto fuente que genera actividad biológica . Por lo tanto, el rango típico para AS-MS es de 400 a 3000 compuestos por grupo. [20] Otras consideraciones para la selección son más prácticas, como la necesidad de equilibrar la concentración deseada del compuesto, que normalmente está en el rango micromolar , con el hecho de que las soluciones madre de compuestos normalmente se almacenan como soluciones 10 milimolares , lo que limita efectivamente el número de compuestos seleccionados en miles. [20] Después de seleccionar e incubar los compuestos de prueba y los objetivos apropiados, los complejos de ligando - proteína se pueden separar por diversos medios. [19]
La selección por afinidad es seguida por la eliminación de moléculas pequeñas no unidas mediante ultrafiltración o cromatografía de exclusión por tamaño , lo que hace que solo los ligandos unidos a proteínas estén disponibles para el análisis posterior. [19] Se han informado varios tipos de ultrafiltración con diferentes grados de rendimiento , incluida la ultrafiltración basada en presión, centrífuga y basada en precipitación . [19] En formatos basados en presión y centrífugos , las moléculas pequeñas no unidas se fuerzan a pasar a través de una membrana semipermeable que excluye las proteínas en función del tamaño. Se requieren múltiples pasos de lavado después de la ultrafiltración para garantizar la eliminación completa de las moléculas pequeñas no unidas . [19] La ultrafiltración también puede confundirse por la adsorción no específica de moléculas pequeñas no unidas a la membrana . [19] Un grupo de la Universidad de Illinois publicó una estrategia de detección que involucraba beta amiloide , en la que se usaban ligandos para estabilizar la proteína y prevenir su agregación. Se utilizó ultrafiltración para precipitar el amiloide beta agregado y eliminar los ligandos no unidos , mientras que la proteína estabilizada por ligando se detectó y cuantificó mediante espectrometría de masas . [19]
La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se utiliza más ampliamente en el descubrimiento de fármacos industriales y tiene la ventaja de una eliminación más eficiente de compuestos no unidos en comparación con la ultrafiltración . [19] Se han descrito enfoques de exclusión por tamaño tanto en formatos basados en cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) como en columnas de centrifugación. [19] En cualquier caso, una mezcla de ligandos no unidos , proteínas y complejos ligando-proteína se pasa a través de una columna de perlas porosas. Los complejos ligando - proteína se excluyen de la entrada a las perlas y salen de la columna rápidamente, mientras que los ligandos no unidos deben viajar a través de las perlas y son retenidos por la columna durante más tiempo. Por lo tanto, se infiere que los ligandos que eluyen de la columna al principio están unidos a una proteína . [19] El sistema de identificación de ligandos automatizado (ALIS), desarrollado por Schering-Plough , utiliza un sistema combinado de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) basado en HPLC que separa los complejos de ligando - proteína de los ligandos no unidos mediante SEC y desvía el complejo hacia un sistema LC-MS para el análisis en línea de los ligandos unidos. [19] SpeedScreen de Novartis utiliza SEC en formato de columna de centrifugación de 96 pocillos , también conocido como cromatografía de filtración en gel , que permite la eliminación simultánea de ligandos no unidos de hasta 96 muestras. [21] Las muestras también pasan a través de perlas porosas, pero se utiliza centrifugación para mover la muestra a través de la columna. [21] SpeedScreen no está acoplado a un sistema LC-MS y requiere un procesamiento adicional antes del análisis final. En este caso, los ligandos deben liberarse de sus objetivos y analizarse por separado.
El paso final requiere la separación bioanalítica de los ligandos unidos de sus objetivos, y la posterior identificación de los ligandos mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas . [20] La AS-MS ofrece medios para identificar interacciones de proteínas y moléculas pequeñas , ya sea directamente (a través de la detección proteómica de arriba hacia abajo de complejos intactos) o indirectamente (a través de la desnaturalización de complejos de proteínas y moléculas pequeñas, seguida de la identificación de moléculas pequeñas mediante espectrometría de masas ). [19] El enfoque de arriba hacia abajo requiere la infusión directa del complejo en una fuente de espectrometría de masas de ionización por electrospray en condiciones lo suficientemente suaves como para preservar la interacción y mantener su integridad en la transición de líquido a gas . [19] Aunque Ganem y Henion demostraron que esto era posible en 1991, no es adecuado para un alto rendimiento . [19] Curiosamente, la disociación por captura de electrones , que normalmente se utiliza en la elucidación de la estructura de péptidos , se ha utilizado para identificar sitios de unión de ligandos durante el análisis de arriba hacia abajo . [19] Un método más simple para el análisis de ligandos unidos utiliza una extracción por precipitación de proteínas para desnaturalizar las proteínas y liberar ligandos en la solución de precipitación, que luego se pueden diluir e identificar en un sistema LC-MS .
La identificación de dianas mediante coelución cromatográfica no depende de las diferencias en la estabilidad de las proteínas después del tratamiento con el fármaco. En cambio, se basa en la suposición de que los fármacos forman complejos estables con sus proteínas diana y que esos complejos son lo suficientemente robustos como para sobrevivir a una separación cromatográfica . En un flujo de trabajo típico, un lisado celular se incuba con un fármaco, luego el lisado se inyecta en un sistema de cromatografía de intercambio iónico y se fracciona . Las proteínas del lisado se eluyen a lo largo de un gradiente de fuerza iónica y las fracciones se recogen en intervalos de tiempo cortos. Cada fracción se analiza mediante LC-MS/MS para determinar el contenido de proteínas y fármaco . Las proteínas individuales eluyen con perfiles característicos y los fármacos preincubados deben reflejar los perfiles de elución de las dianas con las que forman complejos. La correlación de los perfiles de elución de fármacos y proteínas permite delimitar e inferir las dianas. [22]
El desarrollo y la aplicación de ensayos quimioproteómicos de sobremesa suelen requerir mucho tiempo y un coste prohibitivo. Las simulaciones de acoplamiento molecular han surgido como medios de relativamente bajo coste y alto rendimiento para clasificar la fuerza de las interacciones entre proteínas y moléculas pequeñas. El acoplamiento molecular requiere un modelado preciso de la conformación tanto del ligando como de la proteína con resolución atómica y, por lo tanto, se ve facilitado por la determinación empírica de la estructura de la proteína, a menudo mediante métodos ortogonales como la cristalografía de rayos X y la microscopía electrónica criogénica . Las estrategias de acoplamiento molecular se clasifican según el tipo de información que ya se conoce sobre el ligando y la proteína de interés. [23]
Cuando se debe analizar un ligando bioactivo con una estructura conocida frente a una proteína con información estructural limitada, se realiza un modelado con respecto a la estructura del ligando. El modelado de farmacóforos identifica características electrónicas y estructurales clave que están asociadas con la actividad terapéutica en análogos estructurales bioactivos similares y, en consecuencia, requiere grandes bibliotecas con los datos experimentales correspondientes para mejorar el poder predictivo. Las estructuras de los compuestos se superponen virtualmente y los elementos comunes se puntúan en función de su tendencia a la bioactividad. [24] El alejamiento del modelado basado en cerradura y llave hacia el modelado basado en ajuste inducido ha mejorado las predicciones de unión, pero también ha dado lugar al desafío de modelar la flexibilidad del ligando, que requiere la construcción de una base de datos de modelos conformacionales y utiliza grandes cantidades de espacio de almacenamiento de datos. Otro enfoque es el llamado método sobre la marcha, en el que los modelos conformacionales se prueban durante el proceso de modelado de farmacóforos , sin una base de datos; este método requiere significativamente menos espacio de almacenamiento a costa de un alto tiempo de computación. [24] Un segundo desafío surge de la decisión de cómo superponer las estructuras análogas. Un enfoque común es utilizar una regresión de mínimos cuadrados para la superposición, pero esto requiere puntos de anclaje seleccionados por el usuario y, por lo tanto, introduce un sesgo humano en el proceso. Los modelos de farmacóforos requieren conjuntos de datos de entrenamiento, lo que da lugar a otro desafío: la selección de la biblioteca adecuada de compuestos para entrenar adecuadamente los modelos. El tamaño del conjunto de datos y la diversidad química afectan significativamente el rendimiento del producto final. [25]
Idealmente, se conoce la estructura de un objetivo farmacológico, lo que permite el modelado de farmacóforos basado en la estructura . Un modelo basado en la estructura integra propiedades estructurales clave del sitio de unión de la proteína, como la distribución espacial de los puntos de interacción, con características identificadas a partir de modelos de farmacóforos basados en ligando para generar una simulación holística de la interacción ligando-proteína. Un desafío importante en el modelado basado en la estructura es limitar las características del farmacóforo, de las cuales muchas se identifican inicialmente, a un conjunto de características de alta prioridad, ya que modelar demasiadas características es un desafío computacional. Otro desafío es la incompatibilidad del modelado de farmacóforos con el perfil de relación cuantitativa estructura-actividad (QSAR) . Los modelos QSAR precisos dependen de la inclusión de muchos objetivos potenciales, no solo el objetivo terapéutico. Por ejemplo, los farmacóforos importantes pueden producir interacciones de alta afinidad con objetivos terapéuticos, pero también pueden conducir a una actividad indeseable fuera del objetivo , y también pueden ser sustratos de enzimas metabólicas, como el citocromo P450 . Por lo tanto, el modelado de farmacóforos contra objetivos terapéuticos es solo un componente de la relación estructura-actividad total del compuesto . [24]
Las estrategias quimioproteómicas se han utilizado para ampliar el alcance de los objetivos farmacológicos . [26] Si bien los medicamentos históricamente exitosos se dirigen a bolsillos de unión bien definidos de proteínas farmacológicas, estos definen solo alrededor del 15% del proteoma anotado . [26] Para continuar haciendo crecer nuestra farmacopea , se requieren enfoques audaces para el descubrimiento de ligandos. El uso de ABPP ha revigorizado coincidentemente la búsqueda de nuevos sitios ligables. Se ha descubierto que las sondas ABPP, utilizadas intencionalmente para marcar sitios activos de enzimas, marcan muchas regiones nucleofílicas en muchas proteínas diferentes de manera no intencionada. Originalmente se pensó que eran ruido experimental, pero estas reacciones no intencionadas han dado pistas a los investigadores sobre la presencia de sitios que potencialmente pueden ser el objetivo de nuevos fármacos covalentes . Esto es particularmente relevante en el caso de proteínas sin actividad enzimática para inhibir, o con proteínas resistentes a fármacos mutadas. En cualquiera de estos casos, las proteínas pueden potencialmente ser el objetivo de la degradación utilizando la nueva modalidad farmacológica de quimeras dirigidas a la proteólisis (PROTAC) . [26] Los PROTAC son moléculas pequeñas heterobifuncionales que están diseñadas para interactuar con un objetivo y una ligasa de ubiquitina E3 . La interacción acerca la ligasa de ubiquitina E3 lo suficiente al objetivo como para que este quede marcado para su degradación. La existencia de posibles sitios de unión covalente a lo largo del proteoma sugiere que muchos fármacos pueden ser dirigidos covalentemente utilizando dicha modalidad. [26]
La quimioproteómica está a la vanguardia de la reutilización de fármacos . Esto es particularmente relevante en la era de COVID-19 , que vio una necesidad imperiosa de identificar rápidamente los medicamentos aprobados por la FDA que tienen actividad antiviral . [27] En este contexto, generalmente se emplea una prueba fenotípica para identificar medicamentos con un efecto deseado in vitro , como la inhibición de la formación de placa viral . Si un fármaco produce una prueba positiva, el siguiente paso es determinar si está actuando sobre un objetivo conocido o nuevo. La quimioproteómica es, por lo tanto, un seguimiento de la detección fenotípica. En el caso de COVID-19 , Friman et al investigaron los efectos fuera del objetivo del antiviral de amplio espectro Remdesivir , que fue uno de los primeros medicamentos reutilizados que se utilizaron en la pandemia . [27] Remdesivir se probó a través de un perfil de proteoma térmico en un ensayo de desplazamiento térmico celular HepG2 , junto con el controvertido fármaco hidroxicloroquina , y los investigadores descubrieron que TRIP13 era un posible objetivo no deseado de Remdesivir. [27]
Los fármacos aprobados nunca se identifican como éxitos en los análisis de alto rendimiento porque las bibliotecas químicas utilizadas en el análisis no se han optimizado contra ningún objetivo. Sin embargo, métodos como la cromatografía de afinidad y la espectrometría de masas de selección por afinidad son caballos de batalla de la industria farmacéutica , y se ha documentado que la AS-MS en particular produce una cantidad significativa de éxitos en muchas clases de proteínas difíciles de detectar . [20] Esto se debe en gran parte al gran volumen de ligandos que se pueden analizar en un solo ensayo. Los investigadores del Instituto iHuman de la Universidad Tecnológica de Shanghái emplearon un esquema en el que se analizaron 20.000 compuestos por grupo contra A 2A R , un receptor acoplado a proteína G difícil de detectar para el fármaco, con una tasa de éxito del 0,12 %, lo que dio lugar a varios ligandos de alta afinidad. [20]