Las ureasas ( EC 3.5.1.5), funcionalmente, pertenecen a la superfamilia de las amidohidrolasas y fosfotriesterasas. [2] Las ureasas se encuentran en numerosas bacterias , hongos , algas , plantas y algunos invertebrados , así como en los suelos, como enzima del suelo . Son metaloenzimas que contienen níquel de alto peso molecular. [3]
Estas enzimas catalizan la hidrólisis de la urea en dióxido de carbono y amoníaco :
La hidrólisis de la urea se produce en dos etapas. En la primera etapa se produce amoniaco y ácido carbámico . El carbamato se hidroliza espontáneamente y rápidamente a amoniaco y ácido carbónico . La actividad de la ureasa aumenta el pH de su entorno a medida que se produce amoniaco, que es básico.
Su actividad fue identificada por primera vez en 1876 por Frédéric Alphonse Musculus como un fermento soluble. [4] En 1926, James B. Sumner demostró que la ureasa es una proteína al examinar su forma cristalizada. [5] El trabajo de Sumner fue la primera demostración de que una proteína puede funcionar como una enzima y condujo finalmente al reconocimiento de que la mayoría de las enzimas son de hecho proteínas. La ureasa fue la primera enzima cristalizada. Por este trabajo, Sumner recibió el premio Nobel de química en 1946. [6] La estructura cristalina de la ureasa fue resuelta por primera vez por PA Karplus en 1995. [5]
Un estudio de 1984 centrado en la ureasa de la haba canavalia descubrió que el sitio activo contiene un par de centros de níquel . [7] También se ha logrado la activación in vitro con manganeso y cobalto en lugar de níquel. [8] Las sales de plomo son inhibidoras .
El peso molecular es de 480 kDa o 545 kDa para la ureasa de frijol canavalia (masa calculada a partir de la secuencia de aminoácidos). 840 aminoácidos por molécula, de los cuales 90 son residuos de cisteína. [9]
El pH óptimo es 7,4 y la temperatura óptima es 60 °C. Los sustratos incluyen urea e hidroxiurea .
Las ureasas bacterianas se componen de tres subunidades distintas, una catalítica grande (α 60–76 kDa) y dos pequeñas (β 8–21 kDa, γ 6–14 kDa) que comúnmente forman 3 trímeros (αβγ) con una estequiometría con una estructura simétrica doble (nótese que la imagen de arriba da la estructura de la unidad asimétrica, un tercio del verdadero ensamblaje biológico), son enzimas ricas en cisteína, lo que resulta en masas molares enzimáticas entre 190 y 300 kDa. [9]
Una ureasa excepcional se obtiene de Helicobacter sp. Estas están compuestas por dos subunidades, α(26–31 kDa)-β(61–66 kDa). Estas subunidades forman un complejo dodecamérico supramolecular (αβ) 12. [10] de subunidades α-β repetidas, cada par acoplado de subunidades tiene un sitio activo, para un total de 12 sitios activos. [10] Desempeña una función esencial para la supervivencia, neutralizando el ácido gástrico al permitir que la urea ingrese al periplasma a través de un canal de urea controlado por protones . [11] La presencia de ureasa se utiliza en el diagnóstico de especies de Helicobacter .
Todas las ureasas bacterianas son exclusivamente citoplasmáticas, excepto las de Helicobacter pylori , que además de su actividad citoplasmática, tiene actividad externa con las células hospedadoras. En cambio, todas las ureasas vegetales son citoplasmáticas. [9]
Las ureasas de hongos y plantas están formadas por subunidades idénticas (~90 kDa cada una), que se suelen ensamblar como trímeros y hexámeros. Por ejemplo, la ureasa de frijol canavalia tiene dos subunidades estructurales y una catalítica. La subunidad α contiene el sitio activo y está compuesta por 840 aminoácidos por molécula (90 cisteínas). Su masa molecular sin iones Ni(II) es de 90,77 kDa. La masa del hexámero con los 12 iones de níquel es de 545,34 kDa. Otros ejemplos de estructuras homohexaméricas de ureasas de plantas son las de las enzimas de las semillas de soja, guandú y algodón. [9]
Es importante señalar que, aunque están compuestas por diferentes tipos de subunidades, las ureasas de diferentes orígenes, que van desde bacterias hasta plantas y hongos, presentan una alta homología de secuencias de aminoácidos. La cadena única de ureasa de plantas es equivalente a una organización γ-β-α fusionada. La "α" de Helicobacter es equivalente a una fusión de las subunidades γ-β bacterianas normales, mientras que su subunidad "β" es equivalente a la α bacteriana normal. [9] La organización de tres cadenas es probablemente ancestral. [12]
La k cat / K m de la ureasa en el procesamiento de la urea es 10 14 veces mayor que la velocidad de la reacción de eliminación no catalizada de la urea . [5] Hay muchas razones para esta observación en la naturaleza. La proximidad de la urea a los grupos activos en el sitio activo junto con la orientación correcta de la urea permiten que la hidrólisis ocurra rápidamente. La urea por sí sola es muy estable debido a las formas de resonancia que puede adoptar. Se entiende que la estabilidad de la urea se debe a su energía de resonancia , que se ha estimado en 30-40 kcal/mol. [5] Esto se debe a que todas las formas de resonancia zwitteriónica donan electrones al carbono carbonílico , lo que lo hace menos electrófilo y, por lo tanto, menos reactivo al ataque nucleofílico. [5]
El sitio activo de las ureasas se encuentra en las subunidades α (alfa) . Es un centro de níquel dimérico bis-μ-hidroxo, con una distancia interatómica de ~3,5 Å. [5] > El par Ni(II) está débilmente acoplado antiferromagnéticamente . [13] Los estudios de espectroscopia de absorción de rayos X (XAS) de Canavalia ensiformis (alubia canavalia), Klebsiella aerogenes y Sporosarcina pasteurii (antes conocida como Bacillus pasteurii ) [14] confirman 5-6 iones de níquel coordinados con ligadura exclusivamente O/N, incluidos dos ligandos de imidazol por níquel. [8] Se propone que el sustrato de urea desplace a los ligandos aquo .
Las moléculas de agua ubicadas hacia la apertura del sitio activo forman un grupo tetraédrico que llena el sitio de la cavidad a través de enlaces de hidrógeno . Se propone que algunos residuos de aminoácidos formen un colgajo móvil del sitio, que abre la puerta al sustrato. [3] Los residuos de cisteína son comunes en la región del colgajo de las enzimas, que se ha determinado que no son esenciales en la catálisis, aunque participan en el posicionamiento apropiado de otros residuos clave en el sitio activo. [15] En la ureasa de Sporosarcina pasteurii , el colgajo se encontró en la conformación abierta, mientras que su conformación cerrada aparentemente es necesaria para la reacción. [14]
En comparación, las subunidades α de la ureasa de Helicobacter pylori y otras ureasas bacterianas se alinean con las ureasas de la haba canavalia. [15]
No se ha observado la unión de la urea al sitio activo de la ureasa. [9]
Blakely y Zerner propusieron un mecanismo para la catálisis de esta reacción por la ureasa. [16] Comienza con un ataque nucleofílico del oxígeno carbonílico de la molécula de urea sobre el Ni de 5 coordenadas (Ni-1). Un ligando de agua débilmente coordinado se desplaza en su lugar. Un par solitario de electrones de uno de los átomos de nitrógeno en la molécula de urea crea un doble enlace con el carbono central, y el NH 2 − resultante del sustrato coordinado interactúa con un grupo cercano con carga positiva. Blakeley y Zerner propusieron que este grupo cercano fuera un ion carboxilato , aunque los carboxilatos desprotonados tienen carga negativa.
Un ligando hidróxido en el Ni de seis coordenadas es desprotonado por una base. El carbono carbonílico es atacado posteriormente por el oxígeno electronegativo. Un par de electrones del doble enlace nitrógeno-carbono regresa al nitrógeno y neutraliza la carga en él, mientras que el carbono ahora de cuatro coordenadas asume una orientación tetraédrica intermedia.
La descomposición de este intermediario se ve facilitada por un grupo sulfhidrilo de una cisteína situada cerca del sitio activo. Un hidrógeno se une a uno de los átomos de nitrógeno, rompiendo su enlace con el carbono y liberando una molécula de NH3 . Simultáneamente, se rompe el enlace entre el oxígeno y el níquel de 6 coordenadas. Esto deja un ion carbamato coordinado con el Ni de 5 coordenadas, que luego es desplazado por una molécula de agua, regenerando la enzima.
El carbamato producido se degrada espontáneamente para producir otro amoníaco y ácido carbónico . [17]
El mecanismo propuesto por Hausinger y Karplus intenta revisar algunos de los problemas evidentes en la vía de Blakely y Zerner, y se centra en las posiciones de las cadenas laterales que forman el bolsillo de unión de la urea. [5] A partir de las estructuras cristalinas de la ureasa de K. aerogenes , se argumentó que la base general utilizada en el mecanismo de Blakely, His 320 , estaba demasiado lejos del agua unida a Ni2 para desprotonarse con el fin de formar la fracción de hidróxido atacante. Además, no se identificó el ligando ácido general necesario para protonar el nitrógeno de la urea. [18] Hausinger y Karplus sugieren un esquema de protonación inversa, donde una forma protonada del ligando His 320 desempeña el papel del ácido general y el agua unida a Ni2 ya está en el estado desprotonado. [5] El mecanismo sigue el mismo camino, con la base general omitida (ya que ya no es necesaria) y la His 320 donando su protón para formar la molécula de amoníaco, que luego se libera de la enzima. Si bien la mayoría de los ligandos His 320 y el agua unida no estarán en sus formas activas (protonadas y desprotonadas, respectivamente), se calculó que aproximadamente el 0,3% de la enzima ureasa total estaría activa en un momento dado. [5] Si bien, lógicamente, esto implicaría que la enzima no es muy eficiente, al contrario del conocimiento establecido, el uso del esquema de protonación inversa proporciona una ventaja en el aumento de la reactividad para la forma activa, lo que equilibra la desventaja. [5] La colocación del ligando His 320 como un componente esencial en el mecanismo también tiene en cuenta la región de colgajo móvil de la enzima. Como este ligando de histidina es parte del colgajo móvil, la unión del sustrato de urea para la catálisis cierra este colgajo sobre el sitio activo y con la adición del patrón de enlace de hidrógeno a la urea de otros ligandos en el bolsillo, habla de la selectividad de la enzima ureasa para la urea. [5]
El mecanismo propuesto por Ciurli y Mangani [19] es una de las visiones más recientes y actualmente aceptadas del mecanismo de la ureasa y se basa principalmente en los diferentes roles de los dos iones de níquel en el sitio activo. [14] Uno de los cuales se une y activa la urea, el otro ion de níquel se une y activa la molécula de agua nucleófila. [14] Con respecto a esta propuesta, la urea ingresa a la cavidad del sitio activo cuando la "solapa" móvil (que permite la entrada de urea al sitio activo) está abierta. La estabilidad de la unión de la urea al sitio activo se logra a través de una red de enlaces de hidrógeno , que orienta el sustrato hacia la cavidad catalítica. [14] La urea se une al níquel de cinco coordinaciones (Ni1) con el átomo de oxígeno del carbonilo . Se aproxima al níquel de seis coordinaciones (Ni2) con uno de sus grupos amino y posteriormente une los dos centros de níquel. [14] La unión del átomo de oxígeno del carbonilo de la urea a Ni1 se estabiliza a través del estado de protonación de His α222 Nԑ. Además, el cambio conformacional del estado abierto al cerrado de la aleta móvil genera un reordenamiento del grupo carbonilo de Ala α222 de tal manera que su átomo de oxígeno apunta a Ni2. [14] El Ala α170 y el Ala α366 ahora están orientados de una manera que sus grupos carbonilo actúan como aceptores de enlaces de hidrógeno hacia el grupo NH 2 de la urea, ayudando así a su unión a Ni2. [14] La urea es un ligando quelante muy pobre debido al bajo carácter de base de Lewis de sus grupos NH 2. Sin embargo, los oxígenos carbonílicos de Ala α170 y Ala α366 mejoran la basicidad de los grupos NH 2 y permiten la unión a Ni2. [14] Por lo tanto, en este mecanismo propuesto, el posicionamiento de la urea en el sitio activo es inducido por las características estructurales de los residuos del sitio activo que están posicionados para actuar como donadores de enlaces de hidrógeno en la proximidad de Ni1 y como aceptores en la proximidad de Ni2. [14] La principal diferencia estructural entre el mecanismo de Ciurli/Mangani y los otros dos es que incorpora una urea que forma un puente entre nitrógeno y oxígeno y que es atacada por un hidróxido que forma un puente . [17]
Las ureasas bacterianas son a menudo el mecanismo de patogenia de muchas enfermedades. Se asocian con encefalopatía hepática / coma hepático , cálculos infecciosos y úlcera péptica. [20]
Los cálculos urinarios inducidos por infección son una mezcla de estruvita (MgNH 4 PO 4 • 6H 2 O) y carbonato apatita [Ca 10 (PO 4 )6•CO 3 ]. [20] Estos iones polivalentes son solubles pero se vuelven insolubles cuando se produce amoníaco a partir de la ureasa microbiana durante la hidrólisis de la urea , ya que esto aumenta el pH del entorno circundante de aproximadamente 6,5 a 9. [20] La alcalinización resultante da como resultado la cristalización de los cálculos . [20] En los humanos, la ureasa microbiana, Proteus mirabilis , es la más común en los cálculos urinarios inducidos por infección. [21]
Los estudios han demostrado que Helicobacter pylori junto con cirrosis del hígado causan encefalopatía hepática y coma hepático . [22] Helicobacter pylori libera ureasas microbianas en el estómago. La ureasa hidroliza la urea para producir amoníaco y ácido carbónico . Como las bacterias se localizan en el estómago, el amoníaco producido es absorbido fácilmente por el sistema circulatorio desde el lumen gástrico . [22] Esto da como resultado niveles elevados de amoníaco en la sangre, una condición conocida como hiperamonemia ; la erradicación de Helicobacter pylori muestra marcadas disminuciones en los niveles de amoníaco . [22]
Helicobacter pylori también es la causa de úlceras pépticas con su manifestación en 55–68% de los casos reportados. [23] Esto fue confirmado por la disminución del sangrado de la úlcera y la recurrencia de la úlcera después de la erradicación del patógeno . [23] En el estómago hay un aumento en el pH del revestimiento de la mucosa como resultado de la hidrólisis de la urea , que previene el movimiento de iones de hidrógeno entre las glándulas gástricas y el lumen gástrico . [20] Además, las altas concentraciones de amoníaco tienen un efecto sobre las uniones estrechas intercelulares aumentando la permeabilidad y también alterando la membrana mucosa gástrica del estómago. [20] [24]
La urea se encuentra de forma natural en el medio ambiente y también se introduce artificialmente, y comprende más de la mitad de todos los fertilizantes nitrogenados sintéticos utilizados en el mundo. [25] Se cree que el uso intensivo de urea promueve la eutrofización , a pesar de la observación de que la urea se transforma rápidamente por las ureasas microbianas y, por lo tanto, generalmente no persiste. [26] La actividad de la ureasa ambiental a menudo se mide como un indicador de la salud de las comunidades microbianas. En ausencia de plantas, la actividad de la ureasa en el suelo generalmente se atribuye a microorganismos heterótrofos, aunque se ha demostrado que algunas bacterias oxidantes de amonio quimioautotróficas son capaces de crecer en urea como única fuente de carbono, nitrógeno y energía. [27]
La inhibición de la ureasa es un objetivo importante en la agricultura porque la rápida descomposición de los fertilizantes a base de urea es derrochadora y perjudicial para el medio ambiente. [28] El fosforodiamidato de fenilo y la triamida N- ( n -butil)tiofosfórica son dos de estos inhibidores. [29]
Al promover la formación de carbonato de calcio , las ureasas son potencialmente útiles para los procesos inspirados en la biomineralización . [30] En particular, la formación de carbonato de calcio inducida microbiológicamente se puede utilizar para fabricar biohormigón . [31]
Además de actuar como enzima, algunas ureasas (especialmente las vegetales) tienen efectos adicionales que persisten incluso cuando la función catalítica está desactivada. Entre ellos se incluyen la entomotoxicidad, la inhibición de hongos, la neurotoxicidad en mamíferos, la promoción de la endocitosis y la producción de eicosanoides inflamatorios en mamíferos y la inducción de la quimiotaxis en bacterias. Estas actividades pueden ser parte de un mecanismo de defensa. [12]
La toxicidad de la ureasa en insectos se observó originalmente en la canatoxina, una isoforma ortóloga de la ureasa de la soja. La digestión del péptido identificó una porción de 10 kDa, la principal responsable de este efecto, denominada jaburetox. Una porción análoga de la ureasa de la soja se denomina soyuretox. Sin embargo, los estudios en insectos muestran que la proteína entera es tóxica sin necesidad de digestión. No obstante, los péptidos "uretox", al tener una toxicidad más concentrada, son prometedores como biopesticidas . [12]
Muchos patógenos del tracto gastrointestinal o urinario producen ureasa, lo que permite utilizar su detección como diagnóstico para detectar la presencia de patógenos.
Los patógenos ureasa positivos incluyen:
Se conoce una amplia gama de inhibidores de la ureasa de diferentes familias estructurales. La inhibición de la ureasa no solo es de interés para la agricultura, sino también para la medicina, ya que los patógenos como H. pylori producen ureasa como mecanismo de supervivencia. Las clases estructurales conocidas de inhibidores incluyen: [33] [34]
Sumner la aisló por primera vez en forma de cristal en 1926, mediante solvatación con acetona y centrifugación. [36] La bioquímica moderna ha aumentado su demanda de ureasa. La harina de frijol canavalia , [37] las semillas de sandía , [38] y las semillas de guisante [39] han demostrado ser fuentes útiles de ureasa.
