La ingeniería de proteínas es el proceso de desarrollar proteínas útiles o valiosas mediante el diseño y la producción de polipéptidos no naturales , a menudo alterando secuencias de aminoácidos que se encuentran en la naturaleza. [1] Es una disciplina joven, en la que se están realizando muchas investigaciones sobre la comprensión del plegamiento de proteínas y el reconocimiento de los principios de diseño de proteínas . Se ha utilizado para mejorar la función de muchas enzimas para catálisis industrial. [2] También es un mercado de productos y servicios, con un valor estimado de 168 mil millones de dólares para 2017. [3]
Hay dos estrategias generales para la ingeniería de proteínas: diseño racional de proteínas y evolución dirigida . Estos métodos no son mutuamente excluyentes; Los investigadores suelen aplicar ambos. En el futuro, un conocimiento más detallado de la estructura y función de las proteínas y los avances en la detección de alto rendimiento pueden ampliar en gran medida las capacidades de la ingeniería de proteínas. Con el tiempo, se podrán incluir incluso aminoácidos no naturales, mediante métodos más nuevos, como el código genético ampliado , que permite codificar nuevos aminoácidos en el código genético.
En el diseño racional de proteínas, un científico utiliza un conocimiento detallado de la estructura y función de una proteína para realizar los cambios deseados. En general, esto tiene la ventaja de ser económico y técnicamente sencillo, ya que los métodos de mutagénesis dirigida están bien desarrollados. Sin embargo, su principal inconveniente es que a menudo no se dispone de conocimientos estructurales detallados de una proteína e, incluso cuando están disponibles, puede ser muy difícil predecir los efectos de diversas mutaciones, ya que la información estructural suele proporcionar una imagen estática de la estructura de una proteína. Sin embargo, programas como Folding@home y Foldit han utilizado técnicas de crowdsourcing para comprender mejor los motivos de plegamiento de las proteínas. [4]
Los algoritmos computacionales de diseño de proteínas buscan identificar nuevas secuencias de aminoácidos que tienen poca energía cuando se pliegan en la estructura objetivo preespecificada. Si bien el espacio de conformación de secuencias que debe buscarse es grande, el requisito más desafiante para el diseño computacional de proteínas es una función de energía rápida, pero precisa, que pueda distinguir secuencias óptimas de secuencias subóptimas similares.
Sin información estructural sobre una proteína, el análisis de secuencia suele ser útil para dilucidar información sobre la proteína. Estas técnicas implican el alineamiento de secuencias de proteínas diana con otras secuencias de proteínas relacionadas. Esta alineación puede mostrar qué aminoácidos se conservan entre especies y son importantes para la función de la proteína. Estos análisis pueden ayudar a identificar aminoácidos de puntos calientes que pueden servir como sitios objetivo para mutaciones. La alineación de secuencias múltiples utiliza bases de datos como PREFAB, SABMARK, OXBENCH, IRMBASE y BALIBASE para hacer referencias cruzadas de secuencias de proteínas diana con secuencias conocidas. A continuación se enumeran múltiples técnicas de alineación de secuencias. [5] [ página necesaria ]
Este método comienza realizando una alineación de secuencias por pares utilizando métodos k-tuple o Needleman-Wunsch . Estos métodos calculan una matriz que representa la similitud por pares entre los pares de secuencias. Luego, las puntuaciones de similitud se transforman en puntuaciones de distancia que se utilizan para producir un árbol guía utilizando el método de unión de vecinos. Este árbol guía se emplea luego para producir un alineamiento de secuencias múltiples. [5] [ página necesaria ]
Este método es capaz de alinear hasta 190.000 secuencias utilizando el método k-tuple. Las siguientes secuencias se agrupan utilizando los métodos mBed y k -means . Luego se construye un árbol guía utilizando el método UPGMA que utiliza el paquete HH align. Este árbol guía se utiliza para generar múltiples alineamientos de secuencias. [5] [ página necesaria ]
Este método utiliza la transformada rápida de Fourier (FFT) que convierte secuencias de aminoácidos en una secuencia compuesta de valores de volumen y polaridad para cada residuo de aminoácido. Esta nueva secuencia se utiliza para encontrar regiones homólogas. [5] [ página necesaria ]
Este método utiliza el algoritmo de coincidencia de cadenas aproximada de Wu-Manber para generar múltiples alineamientos de secuencias. [5] [ página necesaria ]
Este método utiliza distancias de Kmer y Kimura para generar múltiples alineamientos de secuencias. [5] [ página necesaria ]
Este método utiliza funciones objetivas de coherencia basadas en árboles para la evolución de la alineación. Se ha demostrado que este método es entre un 5% y un 10% más preciso que Clustal W. [5] [ página necesaria ]
El análisis coevolutivo también se conoce como mutación correlacionada, covariación o cosustitución. Este tipo de diseño racional implica cambios evolutivos recíprocos en loci que interactúan evolutivamente. Generalmente, este método comienza con la generación de múltiples alineamientos de secuencia seleccionados para la secuencia objetivo. Luego, esta alineación se somete a un refinamiento manual que implica la eliminación de secuencias muy separadas, así como secuencias con baja identidad de secuencia. Este paso aumenta la calidad de la alineación. A continuación, la alineación procesada manualmente se utiliza para mediciones coevolutivas adicionales utilizando distintos algoritmos de mutación correlacionados. Estos algoritmos dan como resultado una matriz de puntuación de coevolución. Esta matriz se filtra aplicando varias pruebas de significancia para extraer valores de coevolución significativos y eliminar el ruido de fondo. Las mediciones coevolutivas se evalúan más a fondo para evaluar su desempeño y rigor. Finalmente, los resultados de este análisis coevolutivo se validan experimentalmente. [5] [ página necesaria ]
La generación de novo de proteínas se beneficia del conocimiento de las estructuras proteicas existentes. Este conocimiento de la estructura de las proteínas existentes ayuda a predecir nuevas estructuras de proteínas. Los métodos para la predicción de la estructura de proteínas se incluyen en una de las cuatro clases siguientes: ab initio, métodos basados en fragmentos, modelado de homología y enhebrado de proteínas. [5] [ página necesaria ]
Estos métodos implican modelado gratuito sin utilizar ninguna información estructural sobre la plantilla. Los métodos ab initio tienen como objetivo la predicción de las estructuras nativas de las proteínas correspondientes al mínimo global de su energía libre. Algunos ejemplos de métodos ab initio son AMBER, GROMOS, GROMACS, CHARMM, OPLS y ENCEPP12. Los pasos generales para los métodos ab initio comienzan con la representación geométrica de la proteína de interés. A continuación, se desarrolla un modelo de función energética potencial para la proteína. Este modelo se puede crear utilizando potenciales de mecánica molecular o funciones potenciales derivadas de la estructura de proteínas. Tras el desarrollo de un modelo potencial, se aplican a la proteína técnicas de búsqueda de energía que incluyen simulaciones de dinámica molecular, simulaciones de Monte Carlo y algoritmos genéticos. [5] [ página necesaria ]
Estos métodos utilizan información de bases de datos sobre estructuras para hacer coincidir estructuras homólogas con las secuencias de proteínas creadas. Estas estructuras homólogas se ensamblan para obtener estructuras compactas mediante procedimientos de puntuación y optimización, con el objetivo de lograr la puntuación de energía potencial más baja. Los servidores web para información de fragmentos son I-TASSER, ROSETTA, ROSETTA @ home, FRAGFOLD, CABS fold, PROFESY, CREF, QUARK, UNDERTAKER, HMM y ANGLOR. [5] : 72
Estos métodos se basan en la homología de proteínas. Estos métodos también se conocen como modelos comparativos. El primer paso en el modelado de homología es generalmente la identificación de secuencias molde de estructura conocida que sean homólogas a la secuencia de consulta. A continuación, la secuencia de consulta se alinea con la secuencia de la plantilla. Después de la alineación, las regiones estructuralmente conservadas se modelan utilizando la estructura de plantilla. A esto le sigue el modelado de cadenas laterales y bucles distintos de la plantilla. Finalmente la estructura modelada se somete a refinamiento y evaluación de calidad. Los servidores que están disponibles para datos de modelado de homología se enumeran aquí: SWISS MODEL, MODELLER, ReformAlign, PyMOD, TIP-STRUCTFAST, COMPASS, 3d-PSSM, SAMT02, SAMT99, HHPRED, FAGUE, 3D-JIGSAW, META-PP, ROSETTA y I-TASSER. [5] [ página necesaria ]
El enhebrado de proteínas se puede utilizar cuando no se puede encontrar un homólogo confiable para la secuencia de consulta. Este método comienza obteniendo una secuencia de consulta y una biblioteca de estructuras de plantilla. A continuación, la secuencia de consulta se enhebra sobre estructuras de plantilla conocidas. Estos modelos candidatos se califican mediante funciones de puntuación. Estos se califican en función de los modelos de energía potencial de la secuencia de consulta y de plantilla. A continuación se selecciona el modelo que coincida con el modelo de energía potencial más bajo. Los métodos y servidores para recuperar datos de subprocesos y realizar cálculos se enumeran aquí: GenTHREADER, pGenTHREADER, pDomTHREADER, ORFEUS, PROSPECT, BioShell-Threading, FFASO3, RaptorX, HHPred, servidor LOOPP, Sparks-X, SEGMER, THREADER2, ESYPRED3D, LIBRA, TOPITS , RAPTOR, COTH, MUSTER. [5] [ página necesaria ]
Para obtener más información sobre el diseño racional, consulte mutagénesis dirigida al sitio .
La unión multivalente se puede utilizar para aumentar la especificidad y afinidad de unión mediante efectos de avidez . Tener múltiples dominios de unión en una sola biomolécula o complejo aumenta la probabilidad de que se produzcan otras interacciones a través de eventos de unión individuales. La avidez o la afinidad efectiva pueden ser mucho mayores que la suma de las afinidades individuales, lo que proporciona una herramienta rentable y rentable para la unión dirigida. [6]
Las proteínas multivalentes son relativamente fáciles de producir mediante modificaciones postraduccionales o multiplicando la secuencia de ADN que codifica la proteína. La principal ventaja de las proteínas multivalentes y multiespecíficas es que pueden aumentar la afinidad efectiva por un objetivo de una proteína conocida. En el caso de una diana no homogénea, el uso de una combinación de proteínas que da como resultado una unión multiespecífica puede aumentar la especificidad, lo que tiene una gran aplicabilidad en la terapéutica proteica.
El ejemplo más común de unión multivalente son los anticuerpos, y existe una extensa investigación sobre los anticuerpos biespecíficos. Las aplicaciones de los anticuerpos biespecíficos cubren un amplio espectro que incluye diagnóstico, imágenes, profilaxis y terapia. [7] [8]
En la evolución dirigida, se aplica a una proteína mutagénesis aleatoria , por ejemplo mediante PCR propensa a errores o mutagénesis por saturación de secuencia , y se utiliza un régimen de selección para seleccionar variantes que tienen los rasgos deseados. Luego se aplican más rondas de mutación y selección. Este método imita la evolución natural y, en general, produce resultados superiores al diseño racional. Un proceso adicional, denominado mezcla de ADN , mezcla y combina piezas de variantes exitosas para producir mejores resultados. Estos procesos imitan la recombinación que se produce naturalmente durante la reproducción sexual . Las ventajas de la evolución dirigida son que no requiere conocimiento estructural previo de una proteína, ni es necesario poder predecir qué efecto tendrá una mutación determinada. De hecho, los resultados de los experimentos de evolución dirigida suelen ser sorprendentes porque los cambios deseados suelen ser causados por mutaciones que no se esperaba que tuvieran algún efecto. El inconveniente es que requieren un cribado de alto rendimiento , lo que no es factible para todas las proteínas. Se deben mutar grandes cantidades de ADN recombinante y analizar los productos para detectar los rasgos deseados. La gran cantidad de variantes a menudo requiere equipos robóticos costosos para automatizar el proceso. Además, no todas las actividades deseadas pueden detectarse fácilmente.
La evolución darwiniana natural se puede imitar eficazmente en el laboratorio para adaptar las propiedades de las proteínas a diversas aplicaciones, incluida la catálisis. Existen muchas tecnologías experimentales para producir bibliotecas de proteínas grandes y diversas y para detectar o seleccionar variantes funcionales plegadas. Las proteínas plegadas surgen con sorprendente frecuencia en el espacio de secuencia aleatoria, un hecho que se puede aprovechar en la evolución de aglutinantes y catalizadores selectivos. Si bien es más conservador que la selección directa desde el espacio de secuencia profunda, el rediseño de proteínas existentes mediante mutagénesis aleatoria y selección/cribado es un método particularmente sólido para optimizar o alterar las propiedades existentes. También representa un excelente punto de partida para lograr objetivos de ingeniería más ambiciosos. Aliar la evolución experimental con métodos computacionales modernos es probablemente la estrategia más amplia y fructífera para generar macromoléculas funcionales desconocidas para la naturaleza. [9]
Los principales desafíos del diseño de bibliotecas de mutantes de alta calidad han mostrado avances significativos en el pasado reciente. Este progreso se ha producido en forma de mejores descripciones de los efectos de las cargas mutacionales en los rasgos proteicos. Además, los enfoques computacionales han mostrado grandes avances en el innumerable espacio de secuencias hasta tamaños más manejables y seleccionables, creando así bibliotecas inteligentes de mutantes. El tamaño de la biblioteca también se ha reducido a tamaños más seleccionables mediante la identificación de residuos beneficiosos clave utilizando algoritmos para la recombinación sistemática. Finalmente, se ha dado un paso significativo hacia la reingeniería eficiente de las enzimas con el desarrollo de modelos y algoritmos estadísticos más precisos que cuantifican y predicen los efectos mutacionales acoplados sobre las funciones de las proteínas. [10]
Generalmente, la evolución dirigida se puede resumir como un proceso iterativo de dos pasos que implica la generación de bibliotecas de proteínas mutantes y procesos de detección de alto rendimiento para seleccionar variantes con rasgos mejorados. Esta técnica no requiere conocimientos previos de la relación estructura y función de las proteínas. La evolución dirigida utiliza mutagénesis aleatoria o enfocada para generar bibliotecas de proteínas mutantes. Se pueden introducir mutaciones aleatorias mediante PCR propensa a errores o mutagénesis de saturación de sitio. También se pueden generar mutantes utilizando la recombinación de múltiples genes homólogos. La naturaleza ha desarrollado un número limitado de secuencias beneficiosas. La evolución dirigida permite identificar secuencias de proteínas no descubiertas que tienen funciones nuevas. Esta capacidad depende de la capacidad de las proteínas para tolerar sustituciones de residuos de aminoácidos sin comprometer el plegamiento o la estabilidad. [5] [ página necesaria ]
Los métodos de evolución dirigida se pueden clasificar ampliamente en dos estrategias, métodos asexuales y sexuales.
Los métodos asexuales no generan ningún vínculo cruzado entre los genes parentales. Se utilizan genes individuales para crear bibliotecas de mutantes utilizando diversas técnicas mutagénicas. Estos métodos asexuales pueden producir mutagénesis aleatoria o focalizada.
Los métodos mutagénicos aleatorios producen mutaciones aleatorias en todo el gen de interés. La mutagénesis aleatoria puede introducir los siguientes tipos de mutaciones: transiciones, transversiones, inserciones, eliminaciones, inversiones, sin sentido y sin sentido. A continuación se muestran ejemplos de métodos para producir mutagénesis aleatoria.
La PCR propensa a errores utiliza el hecho de que la ADN polimerasa Taq carece de actividad exonucleasa de 3' a 5'. Esto da como resultado una tasa de error del 0,001 al 0,002% por nucleótido por replicación. Este método comienza con la elección del gen, o el área dentro de un gen, que uno desea mutar. A continuación, se calcula el alcance del error requerido en función del tipo y alcance de la actividad que se desea generar. Este grado de error determina la estrategia de PCR propensa a errores que se empleará. Tras la PCR, los genes se clonan en un plásmido y se introducen en sistemas celulares competentes. Luego, estas células se analizan en busca de los rasgos deseados. Luego se aíslan los plásmidos para las colonias que muestran rasgos mejorados y luego se usan como plantillas en la siguiente ronda de mutagénesis. La PCR propensa a errores muestra sesgos para ciertas mutaciones en relación con otras. Como sesgos por transiciones sobre transversiones. [5] [ página necesaria ]
Las tasas de error en PCR se pueden aumentar de las siguientes maneras: [5] [ página necesaria ]
Consulte también reacción en cadena de la polimerasa para obtener más información.
Este método de PCR se basa en la amplificación por círculo rodante, que se basa en el método que utilizan las bacterias para amplificar el ADN circular. Este método da como resultado dúplex de ADN lineales. Estos fragmentos contienen repeticiones en tándem de ADN circular llamadas concatámeros, que pueden transformarse en cepas bacterianas. Las mutaciones se introducen clonando primero la secuencia diana en un plásmido apropiado. A continuación, el proceso de amplificación comienza utilizando cebadores hexámeros aleatorios y ADN polimerasa Φ29 en condiciones de amplificación de círculo rodante propensas a errores. Las condiciones adicionales para producir una amplificación con círculo rodante propensa a errores son 1,5 pM de ADN molde, MnCl 2 1,5 mM y un tiempo de reacción de 24 horas. Se añade MnCl 2 a la mezcla de reacción para promover mutaciones puntuales aleatorias en las cadenas de ADN. Las tasas de mutación pueden aumentarse aumentando la concentración de MnCl 2 o disminuyendo la concentración del ADN molde. La amplificación por círculo rodante propensa a errores es ventajosa en relación con la PCR propensa a errores debido a su uso de cebadores hexámeros aleatorios universales, en lugar de cebadores específicos. Además, los productos de reacción de esta amplificación no necesitan ser tratados con ligasas o endonucleasas. Esta reacción es isotérmica. [5] [ página necesaria ]
La mutagénesis química implica el uso de agentes químicos para introducir mutaciones en secuencias genéticas. A continuación se muestran ejemplos de mutágenos químicos.
El bisulfato de sodio es eficaz para mutar secuencias genómicas ricas en G/C. Esto se debe a que el bisulfato de sodio cataliza la desaminación de la citosina no metilada a uracilo. [5] [ página necesaria ]
El metanosulfonato de etilo alquila residuos de guanidina. Esta alteración provoca errores durante la replicación del ADN. [5] [ página necesaria ]
El ácido nitroso provoca la transversión por desaminación de la adenina y la citosina. [5] [ página necesaria ]
El enfoque dual de la mutagénesis química aleatoria es un proceso iterativo de dos pasos. En primer lugar, se trata de la mutagénesis química in vivo del gen de interés mediante EMS. A continuación, el gen tratado se aísla y se clona en un vector de expresión no tratado para evitar mutaciones en la estructura del plásmido. [5] [ página necesaria ] Esta técnica preserva las propiedades genéticas de los plásmidos. [5] [ página necesaria ]
Este método se ha utilizado para crear mutagénesis in vivo dirigida en levaduras. Este método implica la fusión de una ADN glicosilasa de 3-metiladenina con el dominio de unión al ADN tetR. Se ha demostrado que esto aumenta las tasas de mutación en más de 800 veces en regiones del genoma que contienen sitios tetO. [5] [ página necesaria ]
Este método implica la alteración de la longitud de la secuencia mediante la eliminación e inserción simultánea de fragmentos de bases de longitud arbitraria. Se ha demostrado que este método produce proteínas con nuevas funcionalidades mediante la introducción de nuevos sitios de restricción, codones específicos y codones de cuatro bases para aminoácidos no naturales. [5] [ página necesaria ]
Recientemente se han informado muchos métodos para la mutagénesis aleatoria basada en transposones. Estos métodos incluyen, entre otros, los siguientes: PERMUTE: permutación circular aleatoria, truncamiento aleatorio de proteínas, sustitución aleatoria de tripletes de nucleótidos, inserción aleatoria de dominio/etiqueta/múltiples aminoácidos, mutagénesis de exploración de codones y mutagénesis de exploración multicodón. Todas estas técnicas antes mencionadas requieren el diseño de transposones mini-Mu. Thermo Scientific fabrica kits para el diseño de estos transposones. [5] [ página necesaria ]
Estos métodos implican alterar la longitud del gen mediante mutaciones de inserción y eliminación. Un ejemplo es el método de inserción repetida en tándem (TRINS). Esta técnica da como resultado la generación de repeticiones en tándem de fragmentos aleatorios del gen objetivo mediante amplificación por círculo rodante y la incorporación simultánea de estas repeticiones en el gen objetivo. [5] [ página necesaria ]
Las cepas mutadoras son líneas celulares bacterianas que carecen de uno o más mecanismos de reparación del ADN. Un ejemplo de cadena mutadora es la E. coli XL1-RED. [5] [ página necesaria ] Esta cepa subordinada de E. coli es deficiente en las vías de reparación del ADN MutS, MutD y MutT. El uso de cepas mutadoras es útil para introducir muchos tipos de mutaciones; sin embargo, estas cepas muestran un progresivo deterioro del cultivo debido a la acumulación de mutaciones en el propio genoma de la cepa. [5] [ página necesaria ]
Los métodos mutagénicos enfocados producen mutaciones en residuos de aminoácidos predeterminados. Estas técnicas requieren una comprensión de la relación secuencia-función de la proteína de interés. La comprensión de esta relación permite la identificación de residuos que son importantes en la estabilidad, estereoselectividad y eficiencia catalítica. [5] [ página necesaria ] A continuación se muestran ejemplos de métodos que producen mutagénesis enfocada.
La mutagénesis de saturación de sitio es un método basado en PCR que se utiliza para apuntar a aminoácidos con funciones importantes en la función de las proteínas. Las dos técnicas más comunes para realizar esto son la PCR única de plásmido completo y la PCR de extensión superpuesta.
La PCR única de plásmido completo también se denomina mutagénesis dirigida al sitio (SDM). Los productos SDM se someten a digestión con endonucleasa Dpn. Esta digestión da como resultado la escisión únicamente de la cadena parental, porque la cadena parental contiene un GmATC que está metilado en N6 de adenina. SDM no funciona bien con plásmidos grandes de más de diez kilobases. Además, este método sólo es capaz de sustituir dos nucleótidos a la vez. [5] [ página necesaria ]
La PCR de extensión superpuesta requiere el uso de dos pares de cebadores. Un cebador de cada conjunto contiene una mutación. Se realiza una primera ronda de PCR utilizando estos conjuntos de cebadores y se forman dos dúplex de ADN bicatenario. Luego se realiza una segunda ronda de PCR en la que estos dúplex se desnaturalizan y se hibridan nuevamente con los conjuntos de cebadores para producir heterodúplex, en los que cada cadena tiene una mutación. Cualquier espacio vacío en estos heterodúplex recién formados se llena con ADN polimerasas y se amplifica aún más. [5] [ página necesaria ]
La mutagénesis por saturación de secuencia da como resultado la aleatorización de la secuencia objetivo en cada posición de nucleótido. Este método comienza con la generación de fragmentos de ADN de longitud variable unidos con bases universales mediante el uso de transferasas molde en los extremos 3'. A continuación, estos fragmentos se extienden en toda su longitud utilizando una plantilla monocatenaria. Las bases universales se reemplazan por una base estándar aleatoria, provocando mutaciones. Existen varias versiones modificadas de este método, como SeSAM-Tv-II, SeSAM-Tv+ y SeSAM-III. [5] [ página necesaria ]
Este método de mutagénesis de saturación de sitio implica dos reacciones de PCR separadas. La primera reacción utiliza sólo cebadores directos, mientras que la segunda reacción utiliza sólo cebadores inversos. Esto evita la formación de dímeros de cebador. [5] [ página necesaria ]
Esta técnica mutagénica de saturación de sitio comienza con un oligonucleótido mutagénico y un cebador flanqueante universal. Estos dos reactivos se utilizan para un ciclo de PCR inicial. Los productos de este primer ciclo de PCR se utilizan como megacebadores para la siguiente PCR. [5] [ página necesaria ]
Este método mutagénico de saturación de sitio se basa en la PCR de extensión por superposición. Se utiliza para introducir mutaciones en cualquier sitio de un plásmido circular. [5] [ página necesaria ]
Este método utiliza mutagénesis dirigida al sitio definido por el usuario en uno o varios sitios simultáneamente. OSCARR es un acrónimo de metodología simple de un solo recipiente para aleatorización y recombinación de casetes . Esta aleatorización y recombinación da como resultado la aleatorización de fragmentos deseados de una proteína. Omnichange es una mutagénesis de saturación multisitio independiente de secuencia que puede saturar hasta cinco codones independientes en un gen.
Este método elimina codones redundantes y codones de parada.
Este es un método basado en PCR. La mutagénesis en casete comienza con la síntesis de un casete de ADN que contiene el gen de interés, que está flanqueado a ambos lados por sitios de restricción. La endonucleasa que escinde estos sitios de restricción también escinde sitios en el plásmido diana. Tanto el casete de ADN como el plásmido objetivo se tratan con endonucleasas para escindir estos sitios de restricción y crear extremos pegajosos. A continuación, los productos de esta escisión se ligan entre sí, lo que da como resultado la inserción del gen en el plásmido objetivo. Se utiliza una forma alternativa de mutagénesis en casete llamada mutagénesis en casete combinatoria para identificar las funciones de residuos de aminoácidos individuales en la proteína de interés. La mutagénesis recursiva en conjunto utiliza entonces información de la mutagénesis combinatoria en casete anterior. La mutagénesis del casete de codones le permite insertar o reemplazar un solo codón en un sitio particular en el ADN bicatenario. [5] [ página necesaria ]
Los métodos sexuales de evolución dirigida implican recombinación in vitro que imita la recombinación natural in vivo . Generalmente estas técnicas requieren una alta homología de secuencia entre las secuencias parentales. Estas técnicas se utilizan a menudo para recombinar dos genes parentales diferentes, y estos métodos crean cruces entre estos genes. [5] [ página necesaria ]
La recombinación homóloga se puede clasificar como in vivo o in vitro. La recombinación homóloga in vitro imita la recombinación natural in vivo . Estos métodos de recombinación in vitro requieren una alta homología de secuencia entre las secuencias parentales. Estas técnicas explotan la diversidad natural de los genes parentales recombinándolos para producir genes quiméricos. La quimera resultante muestra una combinación de características parentales. [5] [ página necesaria ]
Esta técnica in vitro fue una de las primeras técnicas en la era de la recombinación. Comienza con la digestión de genes parentales homólogos en pequeños fragmentos mediante la DNasa1. Estos pequeños fragmentos luego se purifican a partir de genes parentales no digeridos. Luego, los fragmentos purificados se reensamblan mediante PCR sin cebador. Esta PCR implica fragmentos homólogos de diferentes genes parentales que se preparan entre sí, lo que da como resultado ADN quimérico. A continuación, el ADN quimérico del tamaño original se amplifica utilizando cebadores terminales en una PCR normal. [5] [ página necesaria ]
Este método de recombinación homóloga in vitro comienza con la síntesis de muchos fragmentos genéticos cortos que presentan mutaciones puntuales utilizando cebadores de secuencia aleatoria. Estos fragmentos se vuelven a ensamblar en genes parentales de longitud completa mediante PCR sin cebador. Estas secuencias reensambladas luego se amplifican mediante PCR y se someten a procesos de selección adicionales. Este método es ventajoso en relación con la mezcla de ADN porque no se utiliza DNasa1, por lo que no hay sesgo para la recombinación junto a un nucleótido de pirimidina. Este método también es ventajoso debido al uso de cebadores aleatorios sintéticos que tienen una longitud uniforme y carecen de sesgos. Finalmente, este método es independiente de la longitud de la secuencia plantilla de ADN y requiere una pequeña cantidad de ADN parental. [5] [ página necesaria ]
Este método genera genes quiméricos directamente a partir de muestras metagenómicas. Comienza con el aislamiento del gen deseado mediante detección funcional a partir de una muestra de ADN metagenómico. A continuación, se diseñan y utilizan cebadores específicos para amplificar los genes homólogos de diferentes muestras ambientales. Finalmente, se generan bibliotecas quiméricas para recuperar los clones funcionales deseados mezclando estos genes homólogos amplificados. [5] [ página necesaria ]
Este método in vitro se basa en el cambio de plantilla para generar genes quiméricos. Este método basado en PCR comienza con una desnaturalización inicial de la plantilla, seguida de la hibridación de cebadores y un corto tiempo de extensión. Todos los ciclos posteriores generan un recocido entre los fragmentos cortos generados en ciclos anteriores y diferentes partes de la plantilla. Estos fragmentos cortos y las plantillas se hibridan entre sí basándose en la complementariedad de secuencia. Este proceso de hibridación de fragmentos de ADN modelo se conoce como cambio de plantilla. Estos fragmentos hibridados servirán como cebadores para una mayor extensión. Este método se lleva a cabo hasta que se obtiene la secuencia del gen quimérico de longitud parental. La ejecución de este método sólo requiere que comiencen los cebadores flanqueantes. Tampoco es necesaria la enzima Dnase1. [5] [ página necesaria ]
Se ha demostrado que este método genera bibliotecas de genes quiméricos con un promedio de 14 cruces por gen quimérico. Comienza alineando fragmentos de una cadena superior parental con la cadena inferior de una plantilla que contiene uracilo de un gen homólogo. Las aletas salientes 5' y 3' se escinden y los espacios se llenan mediante las actividades exonucleasa y endonucleasa de las ADN polimerasas Pfu y taq. A continuación, el molde que contiene uracilo se elimina del heterodúplex mediante tratamiento con una uracilo ADN glicosilasa, seguido de una amplificación adicional mediante PCR. Este método es ventajoso porque genera quimeras con una frecuencia de cruce relativamente alta. Sin embargo, es algo limitado debido a la complejidad y la necesidad de generar ADN monocatenario y ADN molde monocatenario que contenga uracilo. [5] [ página necesaria ]
La mezcla de oligonucleótidos degenerados sintéticos añade flexibilidad a los métodos de mezcla, ya que se pueden incluir oligonucleótidos que contienen codones óptimos y mutaciones beneficiosas. [5] [ página necesaria ]
La clonación realizada en levadura implica el reensamblaje dependiente de PCR de vectores de expresión fragmentados. Estos vectores reensamblados luego se introducen y se clonan en levadura. El uso de levadura para clonar el vector evita la toxicidad y la contraselección que se introducirían mediante ligación y propagación en E. coli. [5] [ página necesaria ]
Este método introduce mutaciones en regiones específicas de genes mientras deja otras partes intactas utilizando la alta frecuencia de recombinación homóloga en la levadura. [5] [ página necesaria ]
Este método utiliza un bacteriófago con un ciclo de vida modificado para transferir genes en evolución de un huésped a otro. El ciclo de vida del fago está diseñado de tal manera que la transferencia se correlaciona con la actividad de interés de la enzima. Este método es ventajoso porque requiere una mínima intervención humana para la evolución continua del gen. [5]
Estos métodos se basan en el hecho de que las proteínas pueden exhibir una identidad estructural similar aunque carezcan de homología de secuencia.
La mezcla de exones es la combinación de exones de diferentes proteínas mediante eventos de recombinación que ocurren en los intrones. La mezcla de exones ortólogos implica combinar exones de genes ortólogos de diferentes especies. La combinación de dominios ortólogos implica la combinación de dominios proteicos completos de genes ortólogos de diferentes especies. La mezcla de exones paráloga implica la mezcla de exones de diferentes genes de la misma especie. La mezcla de dominios parálogos implica la mezcla de dominios proteicos completos a partir de proteínas parálogas de la misma especie. La mezcla de homólogos funcionales implica la mezcla de dominios no homólogos que están relacionados funcionalmente. Todos estos procesos se realizan con amplificación de los exones deseados de diferentes genes utilizando oligonucleótidos sintéticos quiméricos. Estos productos de amplificación luego se reensamblan en genes de longitud completa mediante PCR sin cebador. Durante estos ciclos de PCR los fragmentos actúan como plantillas y cebadores. Esto da como resultado genes quiméricos de longitud completa, que luego se someten a detección. [5] [ página necesaria ]
Los fragmentos de genes parentales se crean mediante digestión controlada mediante la exonucleasa III. Estos fragmentos se despuntan mediante endonucleasa y se ligan para producir genes híbridos. THIOITCHY es una técnica modificada de ITCHY que utiliza análogos de nucleótidos trifosfato, como los dNTP de α-fosfotioato. La incorporación de estos nucleótidos bloquea la digestión por la exonucleasa III. Esta inhibición de la digestión por la exonucleasa III se llama picos. Los picos se pueden lograr truncando primero los genes con exonucleasa para crear fragmentos con protuberancias monocatenarias cortas. Estos fragmentos sirven luego como moldes para la amplificación mediante ADN polimerasa en presencia de pequeñas cantidades de fosfotioato dNTP. Estos fragmentos resultantes luego se ligan entre sí para formar genes de longitud completa. Alternativamente, los genes parentales intactos pueden amplificarse mediante PCR en presencia de dNTP normales y dNTP de fosfotioato. Estos productos de amplificación de longitud completa se someten luego a digestión mediante una exonucleasa. La digestión continuará hasta que la exonucleasa encuentre un α-pdNTP, lo que dará como resultado fragmentos de diferente longitud. Luego, estos fragmentos se ligan entre sí para generar genes quiméricos. [5] [ página necesaria ]
Este método genera bibliotecas de genes híbridos que inhiben múltiples cruces combinando la mezcla de ADN y la picazón. Este método comienza con la construcción de dos bibliotecas ITCHY independientes. El primero con el gen A en el extremo N. Y el otro tiene el gen B en el extremo N. Estos fragmentos de genes híbridos se separan mediante digestión con enzimas de restricción o PCR con cebadores terminales mediante electroforesis en gel de agarosa. Estos fragmentos aislados luego se mezclan y se digieren adicionalmente usando DNase1. Luego, los fragmentos digeridos se reensamblan mediante PCR sin cebador con cambio de plantilla. [5] [ página necesaria ]
Este método genera bibliotecas de genes híbridos mediante el cambio de plantilla de polinucleótidos que crecen unidireccionalmente en presencia de fragmentos de ADN monocatenario como plantillas para quimeras. Este método comienza con la preparación de fragmentos de ADN monocatenario mediante transcripción inversa a partir del ARNm objetivo. Luego, los cebadores específicos de genes se hibridan con el ADN monocatenario. Luego, estos genes se extienden durante un ciclo de PCR. A este ciclo le sigue el cambio de plantilla y la hibridación de los fragmentos cortos obtenidos de la extensión del cebador anterior con otros fragmentos de ADN monocatenario. Este proceso se repite hasta que se obtiene ADN monocatenario de longitud completa. [5] [ página necesaria ]
Este método genera recombinación entre genes con poca o ninguna homología de secuencia. Estas quimeras se fusionan mediante una secuencia conectora que contiene varios sitios de restricción. Luego, esta construcción se digiere usando DNase1. Los fragmentos se hacen con extremos romos usando nucleasa S1. Estos fragmentos de extremos romos se unen en una secuencia circular mediante ligadura. Esta construcción circular luego se linealiza usando enzimas de restricción cuyos sitios de restricción están presentes en la región conectora. Esto da como resultado una biblioteca de genes quiméricos en la que la contribución de los genes a los extremos 5' y 3' se invertirá en comparación con la construcción inicial. [5] [ página necesaria ]
Este método da como resultado una biblioteca de genes con múltiples cruces de varios genes parentales. Este método no requiere identidad de secuencia entre los genes parentales. Esto requiere uno o dos aminoácidos conservados en cada posición de cruce. Comienza con el alineamiento de secuencias parentales y la identificación de regiones de consenso que sirven como sitios de cruce. A esto le sigue la incorporación de etiquetas específicas que contienen sitios de restricción seguida de la eliminación de las etiquetas mediante digestión con Bac1, lo que da como resultado genes con extremos cohesivos. Estos fragmentos de genes se mezclan y ligan en un orden apropiado para formar bibliotecas quiméricas. [5] [ página necesaria ]
Este método comienza con el alineamiento de genes homólogos, seguido de la identificación de regiones de polimorfismo. A continuación, la cadena superior del gen se divide en pequeños oligonucleótidos degenerados. La cadena inferior también se digiere en oligonucleótidos para que sirvan como andamios. Estos fragmentos se combinan en solución y los oligonucleótidos de la cadena superior se ensamblan sobre los oligonucleótidos de la cadena inferior. Los espacios entre estos fragmentos se llenan con polimerasa y se ligan. [5] [ página necesaria ]
Este método implica la mezcla de múltiples fragmentos de ADN sin homología, en una única PCR. Esto da como resultado la reconstrucción de proteínas completas mediante el ensamblaje de módulos que codifican diferentes unidades estructurales. [5] [ página necesaria ]
Este método comienza con la amplificación de fragmentos de genes que deben recombinarse utilizando dNTP de uracilo. Esta solución de amplificación también contiene cebadores, PfuTurbo y ADN polimerasa Cx Hotstart. Los productos amplificados se incuban a continuación con la enzima USER. Esta enzima cataliza la eliminación de residuos de uracilo del ADN creando espacios de un solo par de bases. Los fragmentos tratados con la enzima USER se mezclan y ligan usando ADN ligasa T4 y se someten a digestión con Dpn1 para eliminar el ADN molde. Estos fragmentos de cadena articulada resultantes se someten a amplificación mediante PCR y se transforman en E. coli. [5] [ página necesaria ]
Este método le permite recombinar al menos 9 fragmentos diferentes en un vector aceptor mediante el uso de una enzima de restricción tipo 2 que corta fuera de los sitios de restricción. Comienza con la subclonación de fragmentos en vectores separados para crear secuencias flanqueantes de Bsa1 en ambos lados. Luego, estos vectores se escinden utilizando la enzima de restricción de tipo II Bsa1, que genera cuatro nucleótidos salientes de una sola cadena. Los fragmentos con salientes complementarios se hibridan y ligan usando ADN ligasa T4. Finalmente, estas construcciones se transforman en células de E. coli, en las que se analizan los niveles de expresión. [5] [ página necesaria ]
Este método se puede utilizar para recombinar elementos estructurales o dominios proteicos completos. Este método se basa en la química del fosforotioato, que permite la escisión específica de enlaces fosforotiodiéster. El primer paso del proceso comienza con la amplificación de los fragmentos que deben recombinarse junto con la estructura del vector. Esta amplificación se logra utilizando cebadores con nucleótidos fosforotiolados en los extremos 5'. Los productos de PCR amplificados se escinden en una solución de etanol y yodo a altas temperaturas. A continuación, estos fragmentos se hibridan a temperatura ambiente y se transforman en E. coli, que repara cualquier mella. [5] [ página necesaria ]
Este sistema se basa en un sistema de recombinación específico de sitio natural en E. coli. Este sistema se llama sistema de integrones y produce una mezcla natural de genes. Este método se utilizó para construir y optimizar un operón biosintético de triptófano funcional en E. coli con deficiencia de trp mediante la entrega de casetes de recombinación individuales o genes trpA-E junto con elementos reguladores con el sistema de integrones. [5] [ página necesaria ]
Este método genera cadenas de ADN monocatenario, que abarcan una secuencia de bloque único en el extremo 5' o 3', secuencias complementarias en una región de bucle del tallo y una región de rama D que sirve como sitio de unión del cebador para la PCR. Se mezclan cantidades equivalentes de medias hebras 5' y 3' y se forma un híbrido debido a la complementariedad en la región del tallo. Los híbridos con el extremo 5' libre fosforilado en las medias cadenas 3' se ligan luego con los extremos 3' libres en las medias cadenas 5' utilizando ADN ligasa T4 en presencia de ATP 0,1 mM. Los productos ligados luego se amplifican mediante dos tipos de PCR para generar productos de PCR pre-mitad 5' y pre-mitad 3'. Estos productos de PCR se convierten en cadenas simples mediante la unión de avidina-biotina al extremo 5' de los cebadores que contienen secuencias madre marcadas con biotina. A continuación, las medias cadenas 5' biotiniladas y las medias cadenas 3' no biotiniladas se utilizan como medias cadenas 5' y 3' para el siguiente ciclo de ligadura en Y. [5] [ página necesaria ]
El diseño semirracional utiliza información sobre la secuencia, estructura y función de una proteína, junto con algoritmos predictivos. En conjunto, se utilizan para identificar los residuos de aminoácidos diana que tienen más probabilidades de influir en la función de las proteínas. Las mutaciones de estos residuos de aminoácidos clave crean bibliotecas de proteínas mutantes que tienen más probabilidades de tener propiedades mejoradas. [11]
Los avances en la ingeniería de enzimas semirracionales y el diseño de enzimas de novo brindan a los investigadores nuevas estrategias poderosas y efectivas para manipular biocatalizadores. La integración de enfoques basados en secuencias y estructuras en el diseño de bibliotecas ha demostrado ser una excelente guía para el rediseño de enzimas. En general, los métodos computacionales de novo y de rediseño actuales no se comparan con las variantes evolucionadas en el rendimiento catalítico. Aunque se puede producir una optimización experimental mediante evolución dirigida, se lograrán mejoras adicionales en la precisión de las predicciones de estructuras y una mayor capacidad catalítica con mejoras en los algoritmos de diseño. Es posible que se incluyan más mejoras funcionales en futuras simulaciones mediante la integración de la dinámica de proteínas. [11]
Los estudios bioquímicos y biofísicos, junto con el ajuste de los marcos predictivos, serán útiles para evaluar experimentalmente la importancia funcional de las características de diseño individuales. Una mejor comprensión de estas contribuciones funcionales brindará información para mejorar diseños futuros. [11]
Es probable que la evolución dirigida no sea reemplazada como el método de elección para la ingeniería de proteínas, aunque el diseño computacional de proteínas ha cambiado fundamentalmente la forma en que la ingeniería de proteínas puede manipular biomacromoléculas. Se pueden generar bibliotecas más pequeñas, más enfocadas y funcionalmente ricas mediante el uso de métodos que incorporen marcos predictivos para la ingeniería de proteínas basada en hipótesis. Las nuevas estrategias de diseño y los avances técnicos han iniciado un alejamiento de los protocolos tradicionales, como la evolución dirigida, que representa la estrategia más eficaz para identificar candidatos de alto rendimiento en bibliotecas específicas. La síntesis de bibliotecas de genes completos está reemplazando los protocolos de mezcla y mutagénesis para la preparación de bibliotecas. Además, se aplican cada vez más ensayos de detección de bajo rendimiento altamente específicos en lugar de esfuerzos monumentales de detección y selección de millones de candidatos. En conjunto, estos desarrollos están preparados para llevar la ingeniería de proteínas más allá de la evolución dirigida y hacia estrategias prácticas y más eficientes para adaptar los biocatalizadores. [11]
Una vez que una proteína ha experimentado una evolución dirigida, un diseño de ración o un diseño de semi-ración, las bibliotecas de proteínas mutantes deben examinarse para determinar qué mutantes muestran propiedades mejoradas. Los métodos de presentación en fagos son una opción para detectar proteínas. Este método implica la fusión de genes que codifican los polipéptidos variantes con genes de la proteína de cubierta del fago. Las variantes de proteínas expresadas en las superficies de los fagos se seleccionan mediante unión con objetivos inmovilizados in vitro. Luego, los fagos con variantes de proteínas seleccionadas se amplifican en bacterias, seguido de la identificación de clones positivos mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. Estos fagos seleccionados luego se someten a secuenciación de ADN. [5] [ página necesaria ]
También se pueden utilizar sistemas de presentación en superficie celular para seleccionar bibliotecas de polipéptidos mutantes. Los genes mutantes de la biblioteca se incorporan en vectores de expresión que luego se transforman en células huésped apropiadas. Estas células huésped se someten a métodos de detección de alto rendimiento adicionales para identificar las células con los fenotipos deseados. [5] [ página necesaria ]
Se han desarrollado sistemas de visualización sin células para explotar la traducción de proteínas in vitro o la traducción libre de células. Estos métodos incluyen presentación de ARNm, presentación de ribosomas, presentación de ADN covalente y no covalente y compartimentación in vitro . [5] : 53
La ingeniería enzimática es la aplicación de modificar la estructura de una enzima (y, por tanto, su función) o modificar la actividad catalítica de enzimas aisladas para producir nuevos metabolitos, permitir nuevas vías (catalizadas) para que se produzcan reacciones, [12] o convertir de ciertos compuestos en otros ( biotransformación ). Estos productos son útiles como productos químicos, farmacéuticos, combustibles, alimentos o aditivos agrícolas.
Un reactor enzimático [13] consiste en un recipiente que contiene un medio de reacción que se utiliza para realizar una conversión deseada por medios enzimáticos. Las enzimas utilizadas en este proceso están libres en la solución. También los microorganismos son uno de los orígenes importantes de las verdaderas enzimas. [14]
Se han utilizado métodos informáticos para diseñar una proteína con un pliegue novedoso, como Top7 , [15] y sensores para moléculas no naturales. [16] La ingeniería de proteínas de fusión ha producido rilonacept , un fármaco que ha obtenido la aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para tratar el síndrome periódico asociado a la criopirina .
Otro método informático, IPRO, diseñó con éxito el cambio de la especificidad del cofactor de la xilosa reductasa de Candida boidinii . [17] El rediseño y optimización iterativo de proteínas (IPRO) rediseña las proteínas para aumentar o dar especificidad a sustratos y cofactores nativos o nuevos . Esto se hace perturbando repetidamente y al azar la estructura de las proteínas alrededor de posiciones de diseño específicas, identificando la combinación de rotámeros de menor energía y determinando si el nuevo diseño tiene una energía de enlace más baja que los anteriores. [18]
El diseño asistido por computación también se ha utilizado para diseñar propiedades complejas de un conjunto de nanoproteínas altamente ordenado. [19] La proteína modelo en este estudio es una jaula de proteínas, la bacterioferritina de E. coli (EcBfr), que naturalmente muestra inestabilidad estructural y un comportamiento de autoensamblaje incompleto al poblar dos estados de oligomerización. Mediante análisis computacional y comparación con sus homólogos , se ha descubierto que esta proteína tiene una interfaz dimérica más pequeña que el promedio en su eje de simetría doble debido principalmente a la existencia de una bolsa de agua interfacial centrada en dos residuos de asparagina con puentes de agua. . Para investigar la posibilidad de diseñar EcBfr para la estabilidad estructural modificada, se utiliza un método computacional semiempírico para explorar virtualmente las diferencias de energía de los 480 posibles mutantes en la interfaz dimérica en relación con el EcBfr de tipo salvaje . Este estudio computacional también converge en las asparaginas con puentes de agua . Reemplazar estas dos asparaginas con aminoácidos hidrofóbicos da como resultado proteínas que se pliegan en monómeros alfa-helicoidales y se ensamblan en jaulas, como lo demuestra el dicroísmo circular y la microscopía electrónica de transmisión. Tanto la desnaturalización térmica como la química confirman que todas las proteínas rediseñadas, de acuerdo con los cálculos, poseen una mayor estabilidad. Una de las tres mutaciones cambia la población a favor del estado de oligomerización de orden superior en solución, como lo demuestran tanto la cromatografía de exclusión por tamaño como la electroforesis en gel nativo. [19]
Se desarrolló un método in silico , PoreDesigner, [20] para rediseñar la proteína del canal bacteriano (OmpF) para reducir su tamaño de poro de 1 nm a cualquier dimensión sub-nm deseada. Los experimentos de transporte en los poros diseñados más estrechos revelaron un rechazo total de la sal cuando se ensamblaron en matrices de polímeros en bloques biomiméticos.