La ciclación in situ de proteínas ( INCYPRO ) es una tecnología de ingeniería de proteínas que aumenta la durabilidad de proteínas y enzimas para aplicaciones biotecnológicas y biomédicas. [1] [2] Para tales aplicaciones, es esencial que las proteínas utilizadas mantengan su integridad estructural. [3] Sin embargo, esto a menudo se cuestiona debido a las condiciones requeridas para estas aplicaciones que requieren ingeniería de proteínas para estabilizar la estructura de la proteína. [4] La tecnología INCYPRO implica la unión de enlaces moleculares (entrecruzamientos) a una proteína, reduciendo así la tendencia de la proteína a desplegarse. Las proteínas reticuladas con INCYPRO resultantes son más estables a temperaturas elevadas y en presencia de desnaturalizantes químicos. [5]
La tecnología INCYPRO utiliza moléculas reactivas a tris para entrecruzar tres posiciones definidas dentro de una proteína [1] o un complejo proteico. [6] Por ejemplo, INCYPRO puede implicar la introducción de tres cisteínas espacialmente alineadas y accesibles a disolventes en la proteína que luego se hacen reaccionar con un agente tris-electrófilo. Se ha demostrado que las proteínas o complejos de proteínas reticulados resultantes presentan una mayor estabilidad frente al estrés térmico y químico y una menor tendencia a la agregación. [1] [6] Hasta ahora, la temperatura de fusión de las proteínas se incrementó hasta 39°C en un solo paso de diseño. [6]
Un ejemplo temprano implicó la estabilización de la transpeptidasa Sortasa A, lo que dio como resultado variantes estabilizadas por INCYPRO con actividad a temperatura elevada y en presencia de cloruro de guanidinio . [1] [5] INCYPRO también se ha aplicado para estabilizar el dominio KIX del adaptador humano utilizando diferentes moléculas reticulantes. Aquí, se observó una dependencia de la estabilidad de las proteínas de la hidrofilicidad del entrecruzamiento. [2] Además, se estabilizó una serie de complejos proteicos homotriméricos, incluida la esterasa de Pseudomonas fluorescens (PFE) y una enoil-CoA hidratasa . [6] En estos casos, se generaron conjugados de enzimas con topología bicíclica general.