La electroforesis en gel de poliacrilamida ( PAGE ) es una técnica ampliamente utilizada en bioquímica , química forense , genética , biología molecular y biotecnología para separar macromoléculas biológicas , generalmente proteínas o ácidos nucleicos , según su movilidad electroforética . La movilidad electroforética es una función de la longitud, la conformación y la carga de la molécula. La electroforesis en gel de poliacrilamida es una poderosa herramienta utilizada para analizar muestras de ARN. Cuando el gel de poliacrilamida se desnaturaliza después de la electroforesis, proporciona información sobre la composición de la muestra de las especies de ARN. [1]
La hidratación del acrilonitrilo da como resultado la formación de moléculas de acrilamida ( C3H5NO ) por la nitrilo hidratasa . [2] El monómero de acrilamida está en estado de polvo antes de la adición de agua. La acrilamida es tóxica para el sistema nervioso humano, por lo tanto, se deben seguir todas las medidas de seguridad al trabajar con ella. La acrilamida es soluble en agua y al agregar iniciadores de radicales libres se polimeriza dando como resultado la formación de poliacrilamida. [2] Es útil hacer gel de poliacrilamida a través de la hidratación de la acrilamida porque se puede regular el tamaño de los poros. El aumento de las concentraciones de acrilamida da como resultado una disminución del tamaño de los poros después de la polimerización. El gel de poliacrilamida con poros pequeños ayuda a examinar mejor las moléculas más pequeñas, ya que las moléculas pequeñas pueden ingresar a los poros y viajar a través del gel, mientras que las moléculas grandes quedan atrapadas en las aberturas de los poros.
Al igual que con todas las formas de electroforesis en gel , las moléculas pueden procesarse en su estado nativo , preservando la estructura de orden superior de las moléculas. Este método se denomina PAGE nativo. Alternativamente, se puede agregar un desnaturalizante químico para eliminar esta estructura y convertir la molécula en una molécula no estructurada cuya movilidad depende solo de su longitud (porque todos los complejos proteína-SDS tienen una relación masa-carga similar). Este procedimiento se denomina SDS-PAGE . La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) es un método para separar moléculas en función de la diferencia de su peso molecular. Al pH al que se lleva a cabo la electroforesis en gel, las moléculas de SDS están cargadas negativamente y se unen a las proteínas en una proporción establecida, aproximadamente una molécula de SDS por cada 2 aminoácidos. [3] : 164–79 De esta manera, el detergente proporciona a todas las proteínas una relación carga-masa uniforme. Al unirse a las proteínas, el detergente destruye su estructura secundaria, terciaria y/o cuaternaria desnaturalizándolas y convirtiéndolas en cadenas polipeptídicas lineales con carga negativa. Cuando se someten a un campo eléctrico en PAGE, las cadenas polipeptídicas con carga negativa viajan hacia el ánodo con diferente movilidad. Su movilidad, o la distancia recorrida por las moléculas, es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. [4] Al comparar la relación relativa de la distancia recorrida por cada proteína con la longitud del gel (Rf), se pueden sacar conclusiones sobre el peso molecular relativo de las proteínas, donde la longitud del gel está determinada por la distancia recorrida por una molécula pequeña como un tinte de rastreo. [5]
En el caso de los ácidos nucleicos, la urea es el desnaturalizante más utilizado. En el caso de las proteínas, el dodecil sulfato de sodio (SDS) es un detergente aniónico que se aplica a las muestras de proteínas para recubrirlas y así impartir dos cargas negativas (de cada molécula de SDS) a cada dos aminoácidos de la proteína desnaturalizada. [3] : 161–3 El 2-mercaptoetanol también se puede utilizar para romper los enlaces disulfuro que se encuentran entre los complejos proteicos, lo que ayuda a desnaturalizar aún más la proteína. En la mayoría de las proteínas, la unión del SDS a las cadenas polipeptídicas imparte una distribución uniforme de la carga por unidad de masa, lo que da como resultado un fraccionamiento por tamaño aproximado durante la electroforesis. Las proteínas que tienen un mayor contenido hidrófobo (por ejemplo, muchas proteínas de membrana y las que interactúan con surfactantes en su entorno nativo) son intrínsecamente más difíciles de tratar con precisión utilizando este método, debido a la mayor variabilidad en la proporción de SDS unido. [6] Desde el punto de vista procedimental, se puede utilizar tanto la técnica nativa como la SDS-PAGE en conjunto para purificar y separar las distintas subunidades de la proteína. La técnica nativa-PAGE mantiene intacta la forma oligomérica y mostrará una banda en el gel que es representativa del nivel de actividad. La SDS-PAGE desnaturalizará y separará la forma oligomérica en sus monómeros, mostrando bandas que son representativas de sus pesos moleculares. Estas bandas se pueden utilizar para identificar y evaluar la pureza de la proteína. [3] : 161–3
Las muestras pueden ser cualquier material que contenga proteínas o ácidos nucleicos. Estos pueden ser de origen biológico, por ejemplo, de células procariotas o eucariotas, tejidos, virus, muestras ambientales o proteínas purificadas. En el caso de tejidos o células sólidos, estos suelen descomponerse primero mecánicamente utilizando una batidora (para volúmenes de muestra mayores), utilizando un homogeneizador (volúmenes menores), mediante un sonicador o utilizando ciclos de alta presión, y se puede utilizar una combinación de técnicas bioquímicas y mecánicas (incluidos varios tipos de filtración y centrifugación ) para separar diferentes compartimentos celulares y orgánulos antes de la electroforesis. También se pueden utilizar biomoléculas sintéticas como oligonucleótidos como analitos.
La muestra a analizar se mezcla opcionalmente con un desnaturalizante químico si así se desea, normalmente SDS para proteínas o urea para ácidos nucleicos. El SDS es un detergente aniónico que desnaturaliza las estructuras secundarias y terciarias no unidas por disulfuro, y además aplica una carga negativa a cada proteína en proporción a su masa. La urea rompe los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases del ácido nucleico, lo que hace que las cadenas constituyentes se separen. Calentar las muestras a al menos 60 °C promueve aún más la desnaturalización. [7] [8] [9] [10]
Además del SDS, las proteínas pueden calentarse opcionalmente brevemente hasta casi hervir en presencia de un agente reductor, como ditiotreitol (DTT) o 2-mercaptoetanol (beta-mercaptoetanol/BME) , que desnaturaliza aún más las proteínas al reducir los enlaces disulfuro, superando así algunas formas de plegamiento terciario de proteínas y rompiendo la estructura cuaternaria de las proteínas (subunidades oligoméricas). Esto se conoce como SDS-PAGE reductor.
Se puede añadir un colorante de seguimiento a la solución. Este suele tener una movilidad electroforética mayor que los analitos para permitir que el experimentador siga el progreso de la solución a través del gel durante la prueba electroforética.
Los geles normalmente consisten en acrilamida , bisacrilamida , el desnaturalizante opcional (SDS o urea) y un tampón con un pH ajustado. La solución se puede desgasificar al vacío para evitar la formación de burbujas de aire durante la polimerización. Alternativamente, se puede añadir butanol al gel de resolución (para proteínas) después de verterlo, ya que el butanol elimina las burbujas y suaviza la superficie. [11] Se añade una fuente de radicales libres y un estabilizador, como persulfato de amonio y TEMED , para iniciar la polimerización. [12] La reacción de polimerización crea un gel debido a la bisacrilamida añadida , que puede formar enlaces cruzados entre dos moléculas de acrilamida. La proporción de bisacrilamida a acrilamida se puede variar para fines especiales, pero generalmente es de aproximadamente 1 parte en 35. La concentración de acrilamida del gel también se puede variar, generalmente en el rango del 5% al 25%. Los geles con porcentajes más bajos son mejores para resolver moléculas de peso molecular muy alto, mientras que se necesitan porcentajes mucho más altos de acrilamida para resolver proteínas más pequeñas. El diámetro de poro promedio de los geles de poliacrilamida está determinado por la concentración total de acrilamidas (% T con T = Concentración total de acrilamida y bisacrilamida) y la concentración del agente de reticulación bisacrilamida (% C con C = concentración de bisacrilamida). [13] El tamaño de poro se reduce recíprocamente al % T. Con respecto al % C, una concentración del 5% produce los poros más pequeños, ya que la influencia de la bisacrilamida en el tamaño de poro tiene forma de parábola con un vértice en el 5%.
Los geles se polimerizan normalmente entre dos placas de vidrio en un gelcaster, con un peine insertado en la parte superior para crear los pocillos de muestra. Una vez que el gel se ha polimerizado, se puede retirar el peine y el gel está listo para la electroforesis.
En la electroforesis en gel de poliacrilamida se utilizan distintos sistemas de tampón según la naturaleza de la muestra y el objetivo experimental. Los tampones utilizados en el ánodo y el cátodo pueden ser iguales o diferentes. [9] [14] [15]
Se aplica un campo eléctrico a través del gel, lo que hace que las proteínas o los ácidos nucleicos cargados negativamente migren a través del gel alejándose del electrodo negativo (que es el cátodo, ya que se trata de una celda electrolítica en lugar de galvánica) y hacia el electrodo positivo (el ánodo). Dependiendo de su tamaño, cada biomolécula se mueve de manera diferente a través de la matriz del gel: las moléculas pequeñas pasan más fácilmente por los poros del gel, mientras que las más grandes tienen más dificultades. El gel se deja funcionar normalmente durante unas horas, aunque esto depende del voltaje aplicado a través del gel; la migración se produce más rápidamente a voltajes más altos, pero estos resultados suelen ser menos precisos que a voltajes más bajos. Después de la cantidad de tiempo establecida, las biomoléculas han migrado diferentes distancias según su tamaño. Las biomoléculas más pequeñas viajan más lejos por el gel, mientras que las más grandes permanecen más cerca del punto de origen. Por lo tanto, las biomoléculas pueden separarse aproximadamente según el tamaño, que depende principalmente del peso molecular en condiciones desnaturalizantes, pero también depende de la conformación de orden superior en condiciones nativas. La movilidad del gel se define como la tasa de migración recorrida con un gradiente de voltaje de 1 V/cm y tiene unidades de cm 2 /seg/V. [3] : 161–3 Para fines analíticos, la movilidad relativa de las biomoléculas, R f , la relación entre la distancia recorrida por la molécula en el gel y la distancia total recorrida por un tinte de seguimiento, se representa gráficamente en función del peso molecular de la molécula (o, a veces, el logaritmo del peso molecular, o más bien, el radio molecular M r ). Estos gráficos típicamente lineales representan los marcadores estándar o curvas de calibración que se utilizan ampliamente para la estimación cuantitativa de una variedad de tamaños biomoleculares. [3] : 161–3
Sin embargo, ciertas glicoproteínas se comportan de manera anómala en los geles SDS. Además, también se informa que el análisis de proteínas más grandes, de entre 250.000 y 600.000 Da, es problemático debido a que dichos polipéptidos se mueven de manera incorrecta en los sistemas de gel que se utilizan normalmente. [16]
Después de la electroforesis, el gel puede teñirse (para proteínas, más comúnmente con azul brillante de Coomassie R-250 o autorradiografía; para ácidos nucleicos, bromuro de etidio ; o para cualquiera de ellos, tinción de plata ), lo que permite la visualización de las proteínas separadas, o procesarse más (p. ej., Western blot ). Después de la tinción, las biomoléculas de diferentes especies aparecen como bandas distintas dentro del gel. Es común ejecutar marcadores de tamaño de peso molecular de peso molecular conocido en un carril separado en el gel para calibrar el gel y determinar la masa molecular aproximada de biomoléculas desconocidas comparando la distancia recorrida en relación con el marcador.
En el caso de las proteínas, la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS suele ser la primera opción como ensayo de pureza debido a su fiabilidad y facilidad. La presencia de SDS y el paso de desnaturalización hacen que las proteínas se separen, aproximadamente en función del tamaño, pero puede producirse una migración aberrante de algunas proteínas. También es posible que las distintas proteínas se tiñen de forma diferente, lo que interfiere en la cuantificación mediante tinción. La electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS también se puede utilizar como técnica preparativa para la purificación de proteínas. Por ejemplo, la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS nativa es un método para separar metaloproteínas nativas en matrices biológicas complejas.
El gel de poliacrilamida (PAG) se conocía como un medio de inclusión potencial para seccionar tejidos desde 1964, y dos grupos independientes emplearon PAG en electroforesis en 1959. [17] [18] Posee varias características electroforéticamente deseables que lo convierten en un medio versátil. Es un gel sintético, termoestable, transparente, fuerte, químicamente relativamente inerte y se puede preparar con una amplia gama de tamaños de poro promedio. [19] El tamaño de poro de un gel y la reproducibilidad en el tamaño de poro del gel están determinados por tres factores, la cantidad total de acrilamida presente (%T) (T = concentración total de monómero de acrilamida y bisacrilamida), la cantidad de reticulante (%C) (C = concentración de bisacrilamida) y el tiempo de polimerización de acrilamida (cf. QPNC-PAGE). El tamaño de poro disminuye con el aumento de %T; con reticulación, 5%C da el tamaño de poro más pequeño. Cualquier aumento o disminución del %C a partir del 5% aumenta el tamaño de los poros, ya que el tamaño de los poros con respecto al %C es una función parabólica con vértice en el 5%C. Esto parece deberse a la agrupación no homogénea de las hebras de polímero dentro del gel. Este material de gel también puede soportar gradientes de alto voltaje , es apto para varios procedimientos de tinción y decoloración y se puede digerir para extraer fracciones separadas o secar para autorradiografía y registro permanente.
Los geles de poliacrilamida se componen de un gel de apilamiento y un gel de separación. Los geles de apilamiento tienen una mayor porosidad en relación con el gel de separación y permiten que las proteínas migren en un área concentrada. Además, los geles de apilamiento suelen tener un pH de 6,8, ya que las moléculas de glicina neutras permiten una movilidad más rápida de las proteínas. Los geles de separación tienen un pH de 8,8, donde la glicina aniónica ralentiza la movilidad de las proteínas. Los geles de separación permiten la separación de proteínas y tienen una porosidad relativamente menor. Aquí, las proteínas se separan en función del tamaño (en SDS-PAGE) y el tamaño/carga (PAGE nativa). [20]
El tampón químico estabiliza el valor de pH al valor deseado dentro del propio gel y en el tampón de electroforesis. La elección del tampón también afecta a la movilidad electroforética de los contraiones del tampón y, por lo tanto, a la resolución del gel. El tampón también debe ser no reactivo y no modificar ni reaccionar con la mayoría de las proteínas. Se pueden utilizar diferentes tampones como tampones catódicos y anódicos, respectivamente, según la aplicación. Se pueden utilizar múltiples valores de pH dentro de un solo gel, por ejemplo, en la electroforesis DISC. Los tampones comunes en PAGE incluyen Tris , Bis-Tris o imidazol .
Los contraiones equilibran la carga intrínseca del ion tampón y también afectan la intensidad del campo eléctrico durante la electroforesis. Los iones altamente cargados y móviles a menudo se evitan en los tampones catódicos de SDS-PAGE, pero pueden incluirse en el propio gel, donde migran por delante de la proteína. En aplicaciones como DISC SDS-PAGE, los valores de pH dentro del gel pueden variar para cambiar la carga promedio de los contraiones durante la ejecución para mejorar la resolución. Los contraiones populares son glicina y tricina . La glicina se ha utilizado como fuente de iones de arrastre o iones lentos porque su pKa es 9,69 y la movilidad del glicinato es tal que la movilidad efectiva se puede establecer en un valor inferior al de las proteínas más lentas conocidas de carga neta negativa en el rango de pH. El pH mínimo de este rango es aproximadamente 8,0.
Acrilamida ( C3H5NO ; mW: 71,08) cuando se disuelve en agua, se produce una autopolimerización lenta y espontánea de la acrilamida, uniendo las moléculas mediante el método de cabeza con cola para formar polímeros largos de cadena única. La presencia de un sistema generador de radicales libres acelera enormemente la polimerización. Este tipo de reacción se conoce como polimerización por adición de vinilo . Una solución de estas cadenas de polímero se vuelve viscosa pero no forma un gel, porque las cadenas simplemente se deslizan una sobre otra. La formación de gel requiere unir varias cadenas. La acrilamida es cancerígena , [21] una neurotoxina y una toxina reproductiva. [22] También es esencial almacenar la acrilamida en un lugar fresco, oscuro y seco para reducir la autopolimerización y la hidrólisis .
La bisacrilamida ( N , N' -metilenbisacrilamida ) ( C7H10N2O2 ; mW : 154,17 ) es el agente de reticulación más utilizado para geles de poliacrilamida. Químicamente , se puede pensar en ella como dos moléculas de acrilamida acopladas cabeza con cabeza en sus extremos no reactivos. La bisacrilamida puede reticular dos cadenas de poliacrilamida entre sí, dando como resultado un gel.
El dodecil sulfato de sodio (SDS) ( C 12 H 25 NaO 4 S ; mW: 288,38) (solo se usa en geles desnaturalizantes de proteínas) es un agente detergente fuerte que se usa para desnaturalizar proteínas nativas en polipéptidos individuales . Esta desnaturalización, a la que se hace referencia como desnaturalización reconstructiva, no se logra mediante la linealización total de la proteína, sino a través de un cambio conformacional a una combinación de estructuras secundarias de hélice α y espiral aleatoria. [6] Cuando una mezcla de proteínas se calienta a 100 °C en presencia de SDS, el detergente envuelve la cadena principal del polipéptido. Se une a los polipéptidos en una relación de peso constante de 1,4 g de SDS/g de polipéptido. En este proceso, las cargas intrínsecas de los polipéptidos se vuelven insignificantes en comparación con las cargas negativas aportadas por el SDS. De esta manera, los polipéptidos después del tratamiento se convierten en estructuras similares a varillas que poseen una densidad de carga uniforme, es decir, la misma carga negativa neta por unidad de peso. Las movilidades electroforéticas de estas proteínas son una función lineal de los logaritmos de sus pesos moleculares. Sin SDS, diferentes proteínas con pesos moleculares similares migrarían de manera diferente debido a las diferencias en la relación masa-carga, ya que cada proteína tiene un punto isoeléctrico y un peso molecular particular a su estructura primaria . Esto se conoce como PAGE nativo . Agregar SDS resuelve este problema, ya que se une a la proteína y la despliega, dando una carga negativa casi uniforme a lo largo de la longitud del polipéptido.
La urea ( CO(NH 2 ) 2 ; mW: 60,06) es un agente caotrópico que aumenta la entropía del sistema al interferir con las interacciones intramoleculares mediadas por fuerzas no covalentes como los enlaces de hidrógeno y las fuerzas de van der Waals . La estructura macromolecular depende del efecto neto de estas fuerzas, por lo tanto, se deduce que un aumento de solutos caotrópicos desnaturaliza las macromoléculas.
El persulfato de amonio (APS) ( N2H8S2O8 ; peso molecular: 228,2 ) es una fuente de radicales libres y se utiliza a menudo como iniciador para la formación de geles. Una fuente alternativa de radicales libres es la riboflavina , que genera radicales libres en una reacción fotoquímica .
TEMED ( N , N , N ′, N ′-tetrametiletilendiamina) ( C 6 H 16 N 2 ; mW: 116,21) estabiliza los radicales libres y mejora la polimerización. La velocidad de polimerización y las propiedades del gel resultante dependen de las concentraciones de radicales libres. Aumentar la cantidad de radicales libres da como resultado una disminución en la longitud promedio de la cadena de polímero, un aumento en la turbidez del gel y una disminución en la elasticidad del gel. Disminuir la cantidad muestra el efecto inverso. Se deben utilizar las concentraciones catalíticas más bajas que permitan la polimerización en un período de tiempo razonable. APS y TEMED se utilizan típicamente en concentraciones aproximadamente equimolares en el rango de 1 a 10 mM.
Los siguientes productos químicos y procedimientos se utilizan para el procesamiento del gel y las muestras de proteínas visualizadas en él.
Colorante de seguimiento; como las proteínas y los ácidos nucleicos son en su mayoría incoloros, su progreso a través del gel durante la electroforesis no se puede seguir fácilmente. Por lo tanto, los colorantes aniónicos de una movilidad electroforética conocida se incluyen generalmente en el tampón de muestra de PAGE. Un colorante de seguimiento muy común es el azul de bromofenol (BPB, 3',3",5',5" tetrabromofenolsulfonftaleína). Este colorante se colorea a pH alcalino y neutro y es una pequeña molécula con carga negativa que se mueve hacia el ánodo . Al ser una molécula altamente móvil, se mueve por delante de la mayoría de las proteínas. Cuando llega al extremo anódico del medio de electroforesis, la electroforesis se detiene. Puede unirse débilmente a algunas proteínas y conferir un color azul. Otros colorantes de seguimiento comunes son el xileno cianol , que tiene una movilidad menor, y el naranja G , que tiene una movilidad mayor.
Auxiliares de carga: la mayoría de los sistemas PAGE se cargan desde la parte superior en los pocillos dentro del gel. Para garantizar que la muestra se hunda hasta el fondo del gel, el tampón de muestra se complementa con aditivos que aumentan la densidad de la muestra. Estos aditivos deben ser no iónicos y no reactivos con las proteínas para evitar interferir con la electroforesis. Los aditivos comunes son el glicerol y la sacarosa .
El azul brillante de Coomassie R-250 (CBB) ( C 45 H 44 N 3 NaO 7 S 2 ; peso molecular: 825,97) es el colorante de proteínas más popular. Es un colorante aniónico que se une de forma no específica a las proteínas. La estructura del CBB es predominantemente no polar y se suele utilizar en solución metanólica acidificada con ácido acético. Las proteínas del gel se fijan con ácido acético y se tiñen simultáneamente. El exceso de colorante incorporado al gel se puede eliminar decolorando con la misma solución sin el colorante. Las proteínas se detectan como bandas azules sobre un fondo transparente. Como el SDS también es aniónico, puede interferir en el proceso de tinción. Por lo tanto, se recomienda un gran volumen de solución de tinción, al menos diez veces el volumen del gel.
El bromuro de etidio (EtBr) es una tinción popular para ácidos nucleicos. El EtBr permite visualizar fácilmente el ADN o el ARN en un gel, ya que el EtBr emite una fluorescencia de color naranja bajo la luz ultravioleta. [23] El bromuro de etidio une las cadenas de ácidos nucleicos a través del proceso de intercalación. [3] Si bien el bromuro de etidio es una tinción popular, es importante tener cuidado al usar EtBr, ya que es un carcinógeno conocido . Debido a este hecho, muchos investigadores optan por usar tinciones como SYBR Green y SYBR Safe, que son alternativas más seguras al EtBr. [24] El EtBr se usa simplemente añadiéndolo a la mezcla de gel. Una vez que el gel se ha secado, se puede ver mediante el uso de un sistema de documentación fotográfica. [3]
La tinción con plata se utiliza cuando se necesita un método de detección más sensible, ya que la tinción clásica con azul brillante de Coomassie generalmente puede detectar una banda de proteína de 50 ng. La tinción con plata aumenta la sensibilidad típicamente entre 10 y 100 veces más. Esto se basa en la química del revelado fotográfico. Las proteínas se fijan al gel con una solución de metanol diluida y luego se incuban con una solución ácida de nitrato de plata. Los iones de plata se reducen a su forma metálica mediante formaldehído a pH alcalino. Una solución ácida, como el ácido acético, detiene el revelado. [25] La tinción con plata fue introducida por Kerenyi y Gallyas como un procedimiento sensible para detectar trazas de proteínas en geles . [26] La técnica se ha extendido al estudio de otras macromoléculas biológicas que se han separado en una variedad de soportes. [27] Muchas variables pueden influir en la intensidad del color y cada proteína tiene sus propias características de tinción; el material de vidrio limpio, los reactivos puros y el agua de la más alta pureza son los puntos clave para una tinción exitosa. [28] La tinción con plata se desarrolló en el siglo XIV para colorear la superficie del vidrio. Se ha utilizado ampliamente para este propósito desde el siglo XVI. El color producido por las primeras tinciones con plata oscilaba entre el amarillo claro y el rojo anaranjado. Camillo Golgi perfeccionó la tinción con plata para el estudio del sistema nervioso . El método de Golgi tiñe un número limitado de células al azar en su totalidad. [29]
La autorradiografía, también utilizada para la detección de bandas de proteínas después de la electroforesis en gel, utiliza isótopos radiactivos para marcar las proteínas, que luego se detectan mediante una película de rayos X. [30]
El Western blotting es un proceso mediante el cual las proteínas separadas en el gel de acrilamida se transfieren electroforéticamente a una membrana estable y manipulable, como una membrana de nitrocelulosa , nailon o PVDF . A continuación, es posible aplicar técnicas inmunoquímicas para visualizar las proteínas transferidas, así como para identificar con precisión aumentos o disminuciones relativas de la proteína de interés.
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