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pistola genética

PDS-1000/He Sistema de entrega de partículas

En ingeniería genética , una pistola genética o sistema de administración de partículas biolísticas es un dispositivo que se utiliza para administrar ADN exógeno ( transgenes ), ARN o proteínas a las células. Al recubrir partículas de un metal pesado con un gen de interés y disparar estos microproyectiles dentro de las células usando fuerza mecánica, se puede introducir una integración de la información genética deseada en las células deseadas. La técnica involucrada en la entrega de ADN mediante microproyectiles a menudo se denomina biolística , abreviatura de "balística biológica". [1] [2]

Este dispositivo es capaz de transformar casi cualquier tipo de célula y no se limita a la transformación del núcleo; también puede transformar orgánulos, incluidos plastidios y mitocondrias . [3]

Se utiliza una pistola genética para entregar ADN exógeno a las células. Este método se conoce como "biolística". Las pistolas genéticas se pueden utilizar eficazmente en la mayoría de las células, pero se utilizan principalmente en células vegetales.
  1. El aparato de pistola genética está listo para disparar.
  2. El helio llena la cámara y aumenta la presión contra el disco de ruptura.
  3. La presión eventualmente alcanza el punto donde el disco de ruptura se rompe, y la explosión de helio resultante impulsa el macroportador recubierto de oro/ADN ('Disco de plástico') hacia la pantalla de parada.
  4. Cuando el macroportador golpea la pantalla de parada, las partículas de oro recubiertas de ADN son impulsadas a través de la pantalla hacia las células objetivo.

Diseño de pistola genética

La pistola genética era originalmente una pistola de aire comprimido Crosman modificada para disparar partículas densas de tungsteno . Fue inventado por John C Sanford , Ed Wolf y Nelson Allen en la Universidad de Cornell [4] [5] [6] junto con Ted Klein de DuPont entre 1983 y 1986. El objetivo original eran las cebollas (elegidas por su gran tamaño de celda). , y el dispositivo se utilizó para administrar partículas recubiertas con un gen marcador que transmitiría una señal si se produjera una inserción adecuada de la transcripción de ADN. [7] La ​​transformación genética se demostró tras la expresión observada del gen marcador dentro de las células de la cebolla.

Las primeras pistolas genéticas fabricadas a medida (fabricadas por Nelson Allen) utilizaban un cartucho de pistola de clavos calibre 22 para impulsar un cilindro (bala) de polietileno por un cañón Douglas calibre 22. Se colocó una gota de polvo de tungsteno recubierta con material genético sobre la bala y se disparó a una placa de Petri situada debajo. La bala se soldó al disco debajo de la placa de Petri y el material genético explotó en la muestra con un efecto de rosquilla que implicaba devastación en el medio de la muestra con un anillo de buena transformación alrededor de la periferia. La pistola estaba conectada a una bomba de vacío y se colocó bajo vacío mientras disparaba. El diseño inicial fue puesto en producción limitada por Rumsey-Loomis (un taller de maquinaria local entonces en Mecklenburg Road en Ithaca, Nueva York, EE. UU.).

Biolistics, Inc vendió a Dupont los derechos para fabricar y distribuir un dispositivo actualizado con mejoras que incluyen el uso de helio como propulsor no explosivo y un mecanismo de entrega por colisión de discos múltiples para minimizar el daño a los tejidos de la muestra. Otros metales pesados, como el oro y la plata, también se utilizan para transportar material genético, siendo el oro el preferido debido a su menor citotoxicidad en comparación con los portadores de proyectiles de tungsteno. [8]

Diseño de constructos biolísticos.

La transformación biolística implica la integración de un fragmento funcional de ADN, conocido como construcción de ADN, en las células diana. Una construcción genética es un casete de ADN que contiene todos los elementos reguladores necesarios para la expresión adecuada dentro del organismo objetivo. [9] [ página necesaria ] Si bien las construcciones genéticas pueden variar en su diseño dependiendo del resultado deseado del procedimiento de transformación, todas las construcciones generalmente contienen una combinación de una secuencia promotora , una secuencia terminadora , el gen de interés y un gen informador .

Promotor
Los promotores controlan la ubicación y la magnitud de la expresión genética y funcionan como “el volante y el acelerador” de un gen. [9] [ página necesaria ] Los promotores preceden al gen de interés en la construcción de ADN y pueden modificarse mediante diseño de laboratorio para ajustar la expresión del transgén. El promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor es un ejemplo de un promotor comúnmente utilizado que da como resultado una expresión genética constitutiva sólida dentro de las plantas. [10]
terminador
Las secuencias terminadoras son necesarias para la expresión genética adecuada y se colocan después de la región codificante del gen de interés dentro de la construcción de ADN. Un terminador común para la transformación biolística es el terminador NOS derivado de Agrobacterium tumefaciens . Debido a la alta frecuencia del uso de este terminador en plantas genéticamente modificadas, se han desarrollado estrategias para detectar su presencia en el suministro de alimentos para monitorear cultivos transgénicos no autorizados. [11] [ verificación fallida ]
gen reportero
Un gen que codifica un marcador seleccionable es un elemento común dentro de las construcciones de ADN y se utiliza para seleccionar células transformadas adecuadamente. El marcador seleccionable elegido dependerá de la especie que se transforme, pero normalmente será un gen que otorga a las células una capacidad de desintoxicación para ciertos herbicidas o antibióticos como la kanamicina , la higromicina B o el glifosato [9] [ página necesaria ] . [12] [13] [14]
Elementos adicionales
Los componentes opcionales de una construcción de ADN incluyen elementos tales como secuencias cre-lox que permiten la eliminación controlada de la construcción del genoma objetivo. [15] El desarrollador de la construcción elige dichos elementos para realizar funciones especializadas junto con el gen principal de interés.

Solicitud

Las armas genéticas se utilizan principalmente con células vegetales. Sin embargo, existe un gran uso potencial en humanos y también en otros animales.

Plantas

El objetivo de una pistola genética suele ser un callo de células vegetales indiferenciadas o un grupo de embriones inmaduros que crecen en un medio de gel en una placa de Petri. Una vez que las partículas de oro recubiertas de ADN han llegado a las células, el ADN se utiliza como plantilla para la transcripción (expresión transitoria) y, a veces, se integra en un cromosoma vegetal (transformación "estable").

Si la construcción de ADN administrada contiene un marcador seleccionable, entonces las células transformadas de manera estable se pueden seleccionar y cultivar usando métodos de cultivo de tejidos. Por ejemplo, si la construcción de ADN administrada contiene un gen que confiere resistencia a un antibiótico o herbicida, entonces se pueden seleccionar células transformadas de manera estable incluyendo ese antibiótico o herbicida en el medio de cultivo de tejidos.

Las células transformadas pueden tratarse con una serie de hormonas vegetales, como auxinas y giberelinas , y cada una puede dividirse y diferenciarse en células tisulares organizadas y especializadas de una planta entera. Esta capacidad de regeneración total se llama totipotencia . La nueva planta que se originó a partir de una célula transformada con éxito puede tener nuevos rasgos hereditarios. El uso de la pistola genética puede contrastarse con el uso de Agrobacterium tumefaciens y su plásmido Ti para insertar ADN en células vegetales. Consulte transformación para conocer diferentes métodos de transformación en diferentes especies.

Humanos y otros animales.

También se han utilizado armas genéticas para administrar vacunas de ADN .

La administración de plásmidos a neuronas de rata mediante el uso de una pistola genética, específicamente a neuronas DRG, también se utiliza como precursor farmacológico en el estudio de los efectos de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer .

La pistola genética se ha convertido en una herramienta común para marcar subconjuntos de células en tejidos cultivados. Además de poder transfectar células con plásmidos de ADN que codifican proteínas fluorescentes, la pistola genética se puede adaptar para administrar una amplia variedad de tintes vitales a las células. [dieciséis]

El bombardeo con armas genéticas también se ha utilizado para transformar Caenorhabditis elegans , como alternativa a la microinyección . [17]

Ventajas

La biolística ha demostrado ser un método versátil de modificación genética y generalmente se prefiere para diseñar cultivos resistentes a la transformación, como los cereales . En particular, el maíz Bt es un producto de la biolística. [9] [ página necesaria ] La transformación de plastidios también ha tenido un gran éxito con el bombardeo de partículas en comparación con otras técnicas actuales, como la transformación mediada por Agrobacterium , que tiene dificultades para dirigir el vector al cloroplasto y expresarlo de manera estable en él. [9] [ página necesaria ] [18] Además, no hay informes de que un cloroplasto silencie un transgén insertado con una pistola genética. [19] Además, con solo un disparo de una pistola genética, un técnico calificado puede generar dos organismos transformados en ciertas especies. [18] Esta tecnología incluso ha permitido la modificación de tejidos específicos in situ , aunque es probable que esto dañe un gran número de células y transforme sólo algunas , en lugar de todas, las células del tejido. [20]

Limitaciones

La biolística introduce ADN de forma aleatoria en las células diana. Por tanto, el ADN puede transformarse en cualquier genoma presente en la célula, ya sea nuclear, mitocondrial, plásmido o cualquier otro, en cualquier combinación, aunque un diseño de construcción adecuado puede mitigar esto. La entrega e integración de múltiples plantillas de la construcción de ADN es una posibilidad distinta, lo que da como resultado posibles niveles de expresión variables y números de copias del gen insertado. [9] [ página necesaria ] Esto se debe a la capacidad de las construcciones de dar y recibir material genético de otras construcciones, lo que hace que algunas no porten ningún transgén y otras porten múltiples copias; el número de copias insertadas depende tanto de cuántas copias del transgén tiene una construcción insertada como de cuántas se insertaron. [9] [ página necesaria ] Además, debido a que las construcciones eucariotas dependen de la recombinación ilegítima (un proceso mediante el cual el transgén se integra en el genoma sin secuencias genéticas similares) y no de la recombinación homóloga , no pueden dirigirse a ubicaciones específicas dentro del genoma, [ 9] [ página necesaria ] a menos que el transgén se entregue conjuntamente con reactivos de edición del genoma .

Referencias

  1. ^ O'Brien, John A.; Lummis, Sarah CR (2011). "Nanobiolística: un método de transfección biolística de células y tejidos utilizando una pistola genética con nuevos proyectiles de tamaño nanométrico". BMC Biotecnología . 11 : 66. doi : 10.1186/1472-6750-11-66 . PMC  3144454 . PMID  21663596.
  2. ^ Carter, Matt; Shieh, Jennifer (6 de marzo de 2015). "Capítulo 11: Estrategias de entrega de genes". Prensa académica (Segunda ed.). ISBN 978-0-12-800511-8.
  3. ^ Sanford, John C. (1990). "Transformación biolística de plantas". Fisiología Plantarum . 79 (1): 206–209. doi :10.1111/j.1399-3054.1990.tb05888.x. ISSN  1399-3054.
  4. ^ Segelken, Roger (14 de mayo de 1987). "Un biólogo inventa una pistola para disparar células con ADN" (PDF) . Crónica de Cornell . pag. 3. Archivado desde el original (PDF) el 29 de octubre de 2013 . Consultado el 5 de junio de 2014 .
  5. ^ Sanford, JC; Klein, TM; Lobo, ED; Allen, N. (1987). "Entrega de sustancias a células y tejidos mediante un proceso de bombardeo de partículas". Ciencia y tecnología de partículas . 5 (1): 27–37. doi :10.1080/02726358708904533.
  6. ^ Klein, TM; Lobo, ED; Wu, R.; Sanford, JC (mayo de 1987). "Microproyectiles de alta velocidad para transportar ácidos nucleicos a células vivas". Naturaleza . 327 (6117): 70–73. Código Bib :1987Natur.327...70K. doi :10.1038/327070a0. S2CID  4265777.
  7. ^ Segelken, Roger. "La escopeta genética". Facultad de Agricultura y Ciencias de la Vida de la Universidad de Cornell. Archivado desde el original el 26 de abril de 2010 . Consultado el 5 de junio de 2014 .
  8. ^ Russell, Julie A.; Roy, Mihir K.; Sanford, John C. (1 de marzo de 1992). "El trauma físico y la toxicidad del tungsteno reducen la eficiencia de la transformación biolística". Fisiología de las plantas . 98 (3): 1050-1056. doi : 10.1104/pp.98.3.1050. ISSN  0032-0889. PMC 1080307 . PMID  16668726. 
  9. ^ abcdefgh Pizarrero, Adrián; Scott, Nigel; Fowler, Mark (2008). Biotecnología vegetal: la manipulación genética de las plantas (2 ed.). Oxford, Nueva York, EE.UU.: Oxford University Press Inc. ISBN 978-0-19-928261-6.
  10. ^ Benfey, PN; Chua, N.-H. (16 de noviembre de 1990). "El promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor: regulación combinatoria de la transcripción en plantas". Ciencia . 250 (4983): 959–966. Código Bib : 1990 Ciencia... 250.. 959B. doi : 10.1126/ciencia.250.4983.959. ISSN  0036-8075. PMID  17746920. S2CID  35471862.
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  12. ^ Norris, MH; Kang, Y.; Lu, D.; Wilcox, Licenciatura en Letras; Hoang, TT (31 de julio de 2009). "La resistencia al glifosato como un nuevo marcador no seleccionable con antibióticos y que cumple con los agentes seleccionados en la mutagénesis cromosómica de los genes esenciales asd y dapB de Burkholderia pseudomallei". Microbiología Aplicada y Ambiental . 75 (19): 6062–6075. Código Bib : 2009ApEnM..75.6062N. doi :10.1128/aem.00820-09. ISSN  0099-2240. PMC 2753064 . PMID  19648360. 
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Otras lecturas

enlaces externos