Las sondas fotoactivables , o sondas enjauladas , son agentes celulares ( proteínas , ácidos nucleicos , moléculas pequeñas ) que pueden activarse mediante un destello de luz. Se utilizan en la investigación biológica para estudiar procesos en las células. El principio básico es introducir un agente fotoactivable (por ejemplo, una molécula pequeña modificada con un grupo sensible a la luz: proteínas marcadas con una proteína fotorreceptora artificial ) en células, tejidos o incluso animales vivos y controlar específicamente su actividad mediante iluminación. [1]
La luz es un desencadenante externo muy adecuado para este tipo de experimentos, ya que no es invasiva y no influye en los procesos celulares normales (aunque hay que tener cuidado al utilizar luz en la parte ultravioleta del espectro para evitar dañar el ADN ). Además, la luz ofrece un alto control espacial y temporal. Normalmente, el estímulo de activación proviene de un láser o una lámpara UV y se puede incorporar al mismo microscopio utilizado para monitorizar el efecto. Todas estas ventajas han llevado al desarrollo de una amplia variedad de sondas fotoactivables diferentes.
Aunque el paso de activación inducido por la luz suele ser irreversible, se pueden inducir cambios reversibles en varios fotointerruptores .
El primer uso reportado de análogos fotoprotegidos para estudios biológicos fue la síntesis y aplicación de ATP enjaulado por Joseph F. Hoffman en 1978 [2] en su estudio de bombas Na:K . A partir de 2013, ATP sigue siendo el compuesto enjaulado más comúnmente utilizado. Hoffman también fue quien acuñó el término "enjaulado" para este tipo de moléculas modificadas. Esta nomenclatura persistió, a pesar de ser científicamente un nombre inapropiado , ya que sugiere la idea de que la molécula está en una jaula física (como en un fulereno ). Sin embargo, los científicos han tratado de introducir el término más nuevo y más preciso "sondas fotoactivables". Ambas nomenclaturas están actualmente en uso.
En los años siguientes se hicieron importantes descubrimientos con neurotransmisores enjaulados , como el glutamato , que se utiliza para mapear circuitos neuronales funcionales en cortes de cerebro de mamíferos . [3] Las moléculas pequeñas son más fáciles de modificar por grupos fotoescindibles, en comparación con construcciones más grandes como las proteínas. Las proteínas fotoactivables se descubrieron por casualidad mucho más tarde (en 2002), por la observación de que la proteína Kaede , cuando se dejaba en el banco expuesta a la luz solar, cambiaba la fluorescencia a una longitud de onda más larga. [4]
Las proteínas que detectan y reaccionan a la luz se aislaron originalmente de fotorreceptores en algas , corales y otros organismos marinos. Las dos proteínas fotoactivables más utilizadas en la investigación científica, a partir de 2013, son las proteínas fluorescentes fotoactivables y las proteínas de retinilideno . Las proteínas fluorescentes fotoactivables cambian a una longitud de onda de emisión más larga al ser iluminadas con luz ultravioleta. En Kaede, este cambio se produce por la escisión del tripéptido cromóforo His62-Tyr63-Gly64. [5] Este descubrimiento allanó el camino para las técnicas modernas de microscopía de súper resolución como PALM o STORM. Las proteínas de retinilideno , como las canalrodopsinas o las halorrodopsinas , son canales de cationes y cloruro sensibles a la luz , que se abren durante la iluminación con luz azul y amarilla, respectivamente. Este principio se ha empleado con éxito para controlar la actividad de las neuronas en células vivas e incluso en tejidos y dio lugar a un campo de investigación completamente nuevo, la optogenética .
Los ácidos nucleicos desempeñan papeles importantes como mecanismo de almacenamiento de información celular y de regulación genética . En un esfuerzo por regular esta maquinaria mediante la luz, se han modificado el ADN y el ARN con grupos fotoescindibles en la cadena principal (en un enfoque denominado "enjaulamiento estadístico de la cadena principal"; los grupos de protección reaccionan principalmente con los grupos fosfato de la cadena principal). En el organismo, los ácidos nucleicos modificados son "silenciosos" y solo tras la irradiación con luz se puede activar su actividad. [6] Este enfoque se utiliza en biología del desarrollo , donde la cronología de la actividad genética es de particular interés. Los ácidos nucleicos enjaulados permiten a los investigadores activar con mucha precisión los genes de interés durante el desarrollo de organismos completos. [7]
Las moléculas pequeñas se modifican fácilmente mediante síntesis química y, por lo tanto, fueron de las primeras en modificarse y utilizarse en estudios biológicos. Existe una amplia variedad de moléculas pequeñas enjauladas.
Las reacciones fotoquímicas pueden convertir un reactivo no emisor en un producto fluorescente. [8] Estas reacciones se pueden aprovechar en microscopía de súper resolución para permitir la localización más allá del límite de difracción .
Las ventajas de activar efectores con luz (control preciso, respuesta rápida, alta especificidad, sin reacciones cruzadas) son particularmente interesantes en el caso de los neurotransmisores. Se han sintetizado dopamina enjaulada , serotonina , glicina y GABA y se ha estudiado ampliamente su efecto sobre la actividad neuronal. [9]
No sólo los aminoácidos , sino también los iones pueden ser enjaulados. Dado que el calcio es un potente segundo mensajero celular , se han sintetizado variantes enjauladas empleando las propiedades de captura de iones del EDTA . La escisión inducida por la luz de la cadena principal del EDTA conduce a una ola de calcio libre dentro de la célula. [10]
Otra clase de moléculas utilizadas para transmitir señales en la célula son las hormonas . Se ha demostrado que los derivados enjaulados del estradiol inducen la expresión génica al liberarse de la jaula. Se han utilizado otras hormonas enjauladas para estudiar las interacciones entre receptores y ligandos . [11]
Se ha demostrado que los lípidos participan en la señalización . Para analizar los papeles que desempeñan los lípidos en ciertas vías, es ventajoso poder aumentar la concentración del lípido de señalización de una manera muy rápida. Por lo tanto, muchos lípidos de señalización también se han protegido con grupos de protección fotorremovibles y se ha estudiado su efecto sobre la señalización celular. Se ha demostrado que la PI3P enjaulada induce la fusión endosómica. [12] La IP3 enjaulada ayudó a dilucidar el efecto de la IP3 en el potencial de acción [13] y el diacilglicerol enjaulado se ha utilizado para determinar la influencia de la longitud de la cadena de ácidos grasos en la señalización dependiente de PKC . [14]
En el estudio de las interacciones proteína-lípido , se ha demostrado que otro tipo de fotoactivación aporta muchos conocimientos. Los grupos fotolábiles, como las diaziridinas o las benzofenonas , que, tras la irradiación UV, dejan atrás iones de carbenio altamente reactivos , se pueden utilizar para reticular el lípido de interés con las proteínas con las que interactúa. Esta metodología es especialmente útil para verificar las interacciones proteína-lípido existentes y descubrir otras nuevas. [15]