En microscopía óptica , la inmersión en aceite es una técnica que se utiliza para aumentar el poder de resolución de un microscopio . Esto se logra sumergiendo tanto la lente del objetivo como la muestra en un aceite transparente de alto índice de refracción , aumentando así la apertura numérica de la lente del objetivo.
Sin aceite, las ondas de luz se reflejan en la muestra del portaobjetos a través del cubreobjetos de vidrio, a través del aire y hacia la lente del microscopio (ver la figura coloreada a la derecha). A menos que una onda salga en un ángulo de 90 grados, se dobla cuando choca con una nueva sustancia; la cantidad de curvatura depende del ángulo. Esto distorsiona la imagen. El aire tiene un índice de refracción muy diferente al del vidrio, lo que hace que la curvatura sea mayor en comparación con el aceite, que tiene un índice más similar al del vidrio. El aceite fabricado especialmente puede tener casi exactamente el mismo índice de refracción que el vidrio, lo que hace que una lente sumergida en aceite sea casi tan efectiva como tener una muestra completamente de vidrio (lo que sería poco práctico).
Los aceites de inmersión son aceites transparentes que tienen características ópticas y de viscosidad específicas necesarias para su uso en microscopía. Los aceites que se utilizan habitualmente tienen un índice de refracción de alrededor de 1,515. [1] Un objetivo de inmersión en aceite es una lente de objetivo especialmente diseñada para su uso de esta manera. Muchos condensadores también ofrecen una resolución óptima cuando la lente del condensador está sumergida en aceite.
Las lentes reconstruyen la luz dispersada por un objeto. Para lograr este objetivo, lo ideal es que se recopilen todos los órdenes de difracción. Esto está relacionado con el ángulo de apertura de la lente y su índice de refracción. La resolución de un microscopio se define como la separación mínima necesaria entre dos objetos bajo examen para que el microscopio los distinga como objetos separados. Esta distancia mínima se denomina δ. Si dos objetos están separados por una distancia menor que δ, aparecerán como un solo objeto en el microscopio.
Una medida del poder de resolución, RP, de una lente viene dada por su apertura numérica , NA:
donde λ es la longitud de onda de la luz. De esto se desprende claramente que una buena resolución (δ pequeña) está relacionada con una apertura numérica alta.
La apertura numérica de una lente se define como
donde α 0 es la mitad del ángulo abarcado por la lente del objetivo visto desde la muestra, y n es el índice de refracción del medio entre la lente y la muestra (≈1 para el aire).
Los objetivos de última generación pueden tener una apertura numérica de hasta 0,95. Debido a que sen α 0 es siempre menor o igual a la unidad (el número "1"), la apertura numérica nunca puede ser mayor que la unidad para una lente de objetivo en el aire. Sin embargo, si el espacio entre la lente de objetivo y la muestra está lleno de aceite, la apertura numérica puede obtener valores mayores que la unidad. Esto se debe a que el aceite tiene un índice de refracción mayor que 1.
De lo anterior se desprende que el aceite entre la muestra y la lente del objetivo mejora el poder de resolución en un factor de 1/ n . Los objetivos diseñados específicamente para este fin se conocen como objetivos de inmersión en aceite.
Los objetivos de inmersión en aceite se utilizan únicamente con aumentos muy grandes que requieren un alto poder de resolución. Los objetivos con aumentos de gran potencia tienen distancias focales cortas , lo que facilita el uso de aceite. El aceite se aplica a la muestra (microscopio convencional) y se eleva la platina, sumergiendo el objetivo en aceite. (En los microscopios invertidos, el aceite se aplica al objetivo).
Los índices de refracción del aceite y del vidrio en el primer elemento de la lente son casi iguales, lo que significa que la refracción de la luz será pequeña al entrar en la lente (el aceite y el vidrio son ópticamente muy similares). Se debe utilizar el aceite de inmersión correcto para una lente de objetivo para garantizar que los índices de refracción coincidan estrechamente. El uso de una lente de inmersión en aceite con el aceite de inmersión incorrecto, o sin aceite de inmersión en absoluto, sufrirá aberración esférica. La intensidad de este efecto depende del tamaño de la diferencia de índice de refracción.
La inmersión en aceite generalmente solo se puede utilizar en muestras montadas de forma rígida, de lo contrario, la tensión superficial del aceite puede mover el cubreobjetos y, por lo tanto, la muestra que se encuentra debajo. Esto también puede suceder en microscopios invertidos porque el cubreobjetos se encuentra debajo del portaobjetos.
Antes del desarrollo de los aceites de inmersión sintéticos en la década de 1940, el aceite de cedro se utilizaba ampliamente. El aceite de cedro tiene un índice de refracción de aproximadamente 1,516. La apertura numérica de los objetivos de aceite de cedro suele rondar 1,3. Sin embargo, el aceite de cedro tiene una serie de desventajas: absorbe la luz azul y ultravioleta, amarillea con el tiempo, tiene suficiente acidez para dañar potencialmente los objetivos con el uso repetido (al atacar el cemento utilizado para unir las lentes ) y al diluirlo con disolvente cambia su viscosidad (y su índice de refracción y dispersión ). El aceite de cedro debe eliminarse del objetivo inmediatamente después de su uso antes de que pueda endurecerse, ya que eliminar el aceite de cedro endurecido puede dañar la lente. [2]
En la microscopía moderna, los aceites de inmersión sintéticos son los más utilizados, ya que eliminan la mayoría de estos problemas. [2] Se pueden lograr valores de NA de 1,6 con diferentes aceites. A diferencia de los aceites naturales, los sintéticos no se endurecen en la lente y, por lo general, se pueden dejar en el objetivo durante meses, aunque para mantener mejor un microscopio es mejor quitar el aceite a diario. Con el tiempo, el aceite puede entrar por la lente frontal del objetivo o en el cuerpo del objetivo y dañarlo. Existen diferentes tipos de aceites de inmersión con diferentes propiedades según el tipo de microscopía que se vaya a realizar. El tipo A y el tipo B son aceites de inmersión de uso general con diferentes viscosidades. El aceite de inmersión tipo F se utiliza mejor para imágenes fluorescentes a temperatura ambiente (23 °C), mientras que el aceite tipo N está hecho para usarse a temperatura corporal (37 °C) para aplicaciones de imágenes de células vivas. Todos tienen un D de 1,515, bastante similar al aceite de cedro original. [3]
