La oxidación del ADN es el proceso de daño oxidativo del ácido desoxirribonucleico . Como lo describen en detalle Burrows et al., [1] la 8-oxo-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dG) es la lesión oxidativa más común observada en el ADN dúplex porque la guanina tiene un potencial de reducción de un electrón más bajo que el otros nucleósidos en el ADN. Los potenciales de reducción de un electrón de los nucleósidos (en voltios frente a NHE ) son guanina 1,29, adenina 1,42, citosina 1,6 y timina 1,7. Aproximadamente 1 de cada 40.000 guaninas en el genoma están presentes como 8-oxo-dG en condiciones normales. Esto significa que pueden existir >30.000 8-oxo-dG en cualquier momento dado en el genoma de una célula humana. Otro producto de la oxidación del ADN es el 8-oxo-dA. El 8-oxo-dA ocurre aproximadamente a 1/10 de la frecuencia del 8-oxo-dG. [2] El potencial de reducción de la guanina puede reducirse hasta en un 50%, dependiendo de los nucleósidos vecinos particulares apilados junto a ella dentro del ADN.
El exceso de oxidación del ADN está relacionado con ciertas enfermedades y cánceres, [3] mientras que niveles normales de nucleótidos oxidados, debido a niveles normales de ROS , pueden ser necesarios para la memoria y el aprendizaje. [4] [5]
En 2003, Cooke et al identificaron más de 20 lesiones de bases de ADN dañadas por oxidación. [6] y estos se superponen a las 12 bases oxidadas reportadas en 1992 por Dizdaroglu. [7] Dos de las bases oxidadas más frecuentemente encontradas por Dizdaroglu después de la radiación ionizante (que causa estrés oxidativo) fueron los dos productos de oxidación de la guanina que se muestran en la figura. Uno de estos productos fue 8-OH-Gua (8-hidroxiguanina). (El artículo 8-oxo-2'-desoxiguanosina se refiere a la misma base dañada ya que la forma cetogénica 8-oxo-Gua descrita allí puede sufrir un cambio tautomérico a la forma enólica 8-OH-Gua que se muestra aquí). FapyGua (2,6-diamino-4-hidroxi-5-formamidopirimidina). Otro producto de oxidación frecuente fue la 5-OH-Hyd (5-hidroxihidantoína) derivada de la citosina.
La mayoría de las bases oxidadas se eliminan del ADN mediante enzimas que operan dentro de la vía de reparación por escisión de bases. [6] La eliminación de bases oxidadas en el ADN es bastante rápida. Por ejemplo, el 8-oxo-dG aumentó 10 veces en el hígado de ratones sometidos a radiación ionizante, pero el exceso de 8-oxo-dG se eliminó con una vida media de 11 minutos. [8]
Los niveles en estado estacionario de daños endógenos en el ADN representan el equilibrio entre la formación y la reparación. Swenberg et al. [9] midieron cantidades promedio de daños en el ADN endógeno en estado estacionario en células de mamíferos. Los siete daños más comunes que encontraron se muestran en la Tabla 1. Sólo una base directamente oxidada, la 8-hidroxiguanina , a aproximadamente 2400 8-OH-G por célula, estaba entre los daños más frecuentes al ADN presentes en el estado estacionario.
Según lo revisado por Valavanidis et al. [11] Los niveles elevados de 8-oxo-dG en un tejido pueden servir como biomarcador de estrés oxidativo. También observaron que los niveles elevados de 8-oxo-dG se asocian con frecuencia con carcinogénesis y enfermedades.
En la figura que se muestra en esta sección, el epitelio colónico de un ratón con una dieta normal tiene un nivel bajo de 8-oxo-dG en sus criptas colónicas (panel A). Sin embargo, un ratón que probablemente esté experimentando tumorigénesis colónica (debido al desoxicolato agregado a su dieta [10] ) tiene un alto nivel de 8-oxo-dG en su epitelio colónico (panel B). El desoxicolato aumenta la producción intracelular de oxígeno reactivo, lo que resulta en un aumento del estrés oxidativo, [12] [13] y esto puede contribuir a la tumorigénesis y la carcinogénesis. De 22 ratones alimentados con una dieta suplementada con desoxicolato , 20 (91%) desarrollaron tumores de colon después de 10 meses de dieta, y los tumores en 10 de estos ratones (45% de los ratones) incluyeron un adenocarcinoma (cáncer). [10] Cooke et al. [6] señalan que una serie de enfermedades, como la enfermedad de Alzheimer y el lupus eritematoso sistémico, tienen niveles elevados de 8-oxo-dG pero no un aumento de la carcinogénesis.
Valavanidis et al. [11] señalaron que el daño oxidativo del ADN, como el 8-oxo-dG, puede contribuir a la carcinogénesis mediante dos mecanismos. El primer mecanismo implica la modulación de la expresión genética, mientras que el segundo se produce mediante la inducción de mutaciones.
La alteración epigenética, por ejemplo mediante la metilación de islas CpG en una región promotora de un gen, puede reprimir la expresión del gen (ver Metilación del ADN en el cáncer ). En general, la alteración epigenética puede modular la expresión génica. Según lo revisado por Bernstein y Bernstein, [14] la reparación de varios tipos de daños en el ADN puede, con baja frecuencia, dejar restos de los diferentes procesos de reparación y, por tanto, provocar alteraciones epigenéticas. El 8-oxo-dG se repara principalmente mediante reparación por escisión de base (BER). [15] Li et al. [16] revisaron estudios que indican que una o más proteínas BER también participan en alteraciones epigenéticas que involucran metilación, desmetilación del ADN o reacciones acopladas a la modificación de histonas. Nishida et al. [17] examinaron los niveles de 8-oxo-dG y también evaluaron la metilación del promotor de 11 genes supresores de tumores (TSG) en 128 muestras de biopsia de hígado. Estas biopsias se tomaron de pacientes con hepatitis C crónica, una enfermedad que provoca daños oxidativos en el hígado. Entre los 5 factores evaluados, solo los niveles elevados de 8-oxo-dG estuvieron altamente correlacionados con la metilación del promotor de los TSG (p<0,0001). Esta metilación del promotor podría haber reducido la expresión de estos genes supresores de tumores y contribuido a la carcinogénesis .
Yasui et al. [18] examinaron el destino de 8-oxo-dG cuando este derivado oxidado de desoxiguanosina se insertó en el gen de la timidina quinasa en un cromosoma dentro de células linfoblastoides humanas en cultivo. Insertaron 8-oxo-dG en aproximadamente 800 células y pudieron detectar los productos que se produjeron después de la inserción de esta base alterada, según lo determinado a partir de los clones producidos después del crecimiento de las células. 8-oxo-dG se restauró a G en el 86% de los clones, lo que probablemente refleja una reparación por escisión de base precisa o una síntesis de translesión sin mutación. Se produjeron transversiones de G:C a T:A en el 5,9% de los clones, deleciones de una sola base en el 2,1% y transversiones de G:C a C:G en el 1,2%. En conjunto, estas mutaciones más comunes sumaron el 9,2% del 14% de las mutaciones generadas en el sitio de inserción de 8-oxo-dG. Entre las otras mutaciones en los 800 clones analizados, también hubo 3 deleciones más grandes, de tamaños de 6, 33 y 135 pares de bases. Por lo tanto, si no se repara, el 8-oxo-dG puede causar directamente mutaciones frecuentes, algunas de las cuales pueden contribuir a la carcinogénesis .
Según lo revisado por Wang et al., [19] la guanina oxidada parece tener múltiples funciones reguladoras en la expresión genética. Como señalaron Wang et al., [19] los genes propensos a transcribirse activamente están densamente distribuidos en regiones del genoma con alto contenido de GC. Luego describieron tres modos de regulación genética mediante la oxidación del ADN en la guanina. Por un lado, parece que el estrés oxidativo puede producir 8-oxo-dG en un promotor de un gen. El estrés oxidativo también puede inactivar OGG1. El OGG1 inactivo, que ya no escinde 8-oxo-dG, sin embargo se dirige y forma complejos con 8-oxo-dG y provoca una curvatura pronunciada (~70 o ) en el ADN. Esto permite el ensamblaje de un complejo de iniciación transcripcional, que regula positivamente la transcripción del gen asociado. La base experimental que establece este modo también fue revisada por Seifermann y Epe [20].
Un segundo modo de regulación genética mediante la oxidación del ADN en una guanina, [19] [21] ocurre cuando se forma un 8-oxo-dG en una secuencia potencialmente formadora de cuádruplex G (PQS) rica en guanina en la cadena codificante de una promotor, después de lo cual el OGG1 activo escinde el 8-oxo-dG y genera un sitio apurínico/apirimidínico (sitio AP). El sitio AP permite la fusión del dúplex para desenmascarar el PQS, adoptando un pliegue cuádruplex G (estructura/motivo G4) que tiene un papel regulador en la activación de la transcripción.
Un tercer modo de regulación genética mediante la oxidación del ADN en una guanina [19] ocurre cuando 8-oxo-dG forma un complejo con OGG1 y luego recluta remodeladores de cromatina para modular la expresión génica. La proteína de unión al ADN cromodominio helicasa 4 (CHD4) , un componente del complejo (NuRD) , es reclutada por OGG1 en los sitios de daño oxidativo del ADN. Luego, CHD4 atrae el ADN y las enzimas metilantes de histonas que reprimen la transcripción de los genes asociados.
Seifermann y Epe [20] observaron que la inducción altamente selectiva de 8-oxo-dG en las secuencias promotoras observadas en la inducción de la transcripción puede ser difícil de explicar como consecuencia del estrés oxidativo general. Sin embargo, parece haber un mecanismo para la generación dirigida de bases oxidadas en las regiones promotoras. Perillo et al., [22] [23] demostraron que la histona desmetilasa LSD1 específica de lisina genera una explosión local de especies reactivas de oxígeno (ROS) que induce la oxidación de los nucleótidos cercanos cuando lleva a cabo su función. Como ejemplo específico, después del tratamiento de las células con un estrógeno, el LSD1 produjo H 2 O 2 como subproducto de su actividad enzimática. Se demostró que la oxidación del ADN por LSD1 en el curso de la desmetilación de la histona H3 en la lisina 9 es necesaria para el reclutamiento de OGG1 y también de la topoisomerasa IIβ en la región promotora de bcl-2 , un gen que responde a los estrógenos, y su posterior transcripción. iniciación.
El 8-oxo-dG no aparece al azar en el genoma. En fibroblastos embrionarios de ratón , se encontró un enriquecimiento de 2 a 5 veces de 8-oxo-dG en regiones de control genético, incluidos promotores , regiones 5' no traducidas y regiones 3' no traducidas en comparación con los niveles de 8-oxo-dG encontrados en el gen cuerpos y en regiones intergénicas . [24] En células endoteliales de la arteria pulmonar de rata, cuando se examinaron 22.414 genes codificadores de proteínas en busca de ubicaciones de 8-oxo-dG, la mayoría de los 8-oxo-dG (cuando estaban presentes) se encontraron en regiones promotoras en lugar de dentro de cuerpos genéticos. [25] Entre cientos de genes cuyos niveles de expresión se vieron afectados por la hipoxia, aquellos con el promotor 8-oxo-dG recién adquirido estaban regulados al alza , y aquellos genes cuyos promotores perdieron 8-oxo-dG estaban casi todos regulados a la baja . [25]
La oxidación de guanina, particularmente dentro de los sitios CpG , puede ser especialmente importante en el aprendizaje y la memoria. La metilación de citosinas ocurre en 60 a 90% de los sitios CpG, según el tipo de tejido. [26] En el cerebro de los mamíferos, ~62% de los CpG están metilados. [26] La metilación de sitios CpG tiende a silenciar genes de forma estable. [27] Más de 500 de estos sitios CpG se desmetilan en el ADN de las neuronas durante la formación y consolidación de la memoria en las regiones del hipocampo [28] [29] y la corteza cingulada [29] del cerebro. Como se indica a continuación, el primer paso en la desmetilación de la citosina metilada en un sitio CpG es la oxidación de la guanina para formar 8-oxo-dG.
La primera figura de esta sección muestra un sitio CpG donde la citosina se metila para formar 5-metilcitosina (5 mC) y la guanina se oxida para formar 8-oxo-2'-desoxiguanosina (en la figura, esto se muestra en la forma tautomérica 8 -OHdG). Cuando se forma esta estructura, la enzima reparadora de escisión de bases OGG1 se dirige a 8-OHdG y se une a la lesión sin escisión inmediata. OGG1, presente en un sitio de 5mCp-8-OHdG, recluta TET1 , y TET1 oxida el 5mC adyacente al 8-OHdG. Esto inicia la desmetilación de 5 mC. [30] TET1 es una enzima clave involucrada en la desmetilación de 5mCpG. Sin embargo, TET1 solo es capaz de actuar sobre 5mCpG si la guanina se oxidó primero para formar 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (8-OHdG o su tautómero 8-oxo-dG), lo que da como resultado un dinucleótido de 5mCp-8-OHdG ( ver la primera figura de esta sección). [30] Esto inicia la vía de desmetilación de la citosina metilada, lo que finalmente da como resultado una citosina no metilada, como se muestra en la segunda figura de esta sección.
La expresión alterada de proteínas en las neuronas, debido a cambios en la metilación del ADN (probablemente controlada por la desmetilación dependiente de 8-oxo-dG de los sitios CpG en los promotores de genes dentro del ADN de las neuronas) se ha establecido como fundamental para la formación de la memoria. [32]
Raza et al. han revisado la evidencia de que el daño al ADN inducido por el estrés oxidativo desempeña un papel en el trastorno bipolar . [33] Los pacientes bipolares tienen niveles elevados de daños en las bases del ADN inducidos por oxidación incluso durante períodos de estado mental estable. [34] El nivel de la enzima reparadora por escisión de bases OGG1 que elimina ciertas bases oxidadas del ADN también se reduce en comparación con individuos sanos. [34]
El trastorno depresivo mayor se asocia con un aumento del daño oxidativo del ADN. [33] Los aumentos en las modificaciones oxidativas de purinas y pirimidinas en pacientes depresivos pueden deberse a una reparación deficiente de los daños oxidativos del ADN. [35]
Los estudios post mortem de pacientes ancianos con esquizofrenia crónica mostraron que el daño oxidativo del ADN aumenta en la región del hipocampo del cerebro. [36] La proporción media de neuronas con la base de ADN oxidada 8-oxo-dG fue 10 veces mayor en pacientes con esquizofrenia que en individuos de comparación. Raza et al. han revisado la evidencia que indica un papel del daño oxidativo del ADN en la esquizofrenia. [33] y Markkanen et al. [37]
Los ARN en el medio nativo están expuestos a diversos ataques. Entre estas amenazas, el estrés oxidativo es una de las principales causas de daño a los ARN. El nivel de estrés oxidativo que soporta una célula se refleja en la cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS). Las ROS se generan a partir del metabolismo normal del oxígeno en las células y se reconocen como una lista de moléculas activas, como O 2 • − , 1 O 2 , H 2 O 2 y •OH . [38] Un ácido nucleico puede ser oxidado por ROS mediante una reacción de Fenton . [39] Hasta la fecha, se han descubierto alrededor de 20 lesiones oxidativas en el ADN. [40] Es probable que los ARN sean más sensibles a las ROS por las siguientes razones: i) la estructura básicamente monocatenaria expone más sitios a las ROS; ii) en comparación con el ADN nuclear, los ARN están menos compartimentados; iii) Los ARN se distribuyen ampliamente en las células no sólo en el núcleo como lo hacen los ADN, sino también en grandes porciones en el citoplasma. [41] [42] Esta teoría ha sido respaldada por una serie de descubrimientos a partir de hígados de rata, leucocitos humanos , etc. En realidad, el seguimiento de un sistema mediante la aplicación de la marca isotópica [ 18 O]-H 2 O 2 muestra una mayor oxidación en el ARN celular. que en el ADN. La oxidación daña aleatoriamente los ARN y cada ataque trae problemas al metabolismo celular normal. Aunque la alteración de la información genética en el ARNm es relativamente rara, la oxidación de los ARNm in vitro e in vivo produce una baja eficiencia de traducción y productos proteicos aberrantes. [43] Aunque la oxidación ataca las cadenas nucleicas de forma aleatoria, determinados residuos son más susceptibles a las ROS, ya que estos puntos críticos son afectados por las ROS a un ritmo elevado. Entre todas las lesiones descubiertas hasta el momento, una de las más abundantes en el ADN y el ARN es la 8-hidroxiguanina. [44] Además, la 8-hidroxiguanina es la única mensurable entre todas las lesiones de ARN. Además de su abundancia, la 8-hidroxidesoxiguanosina (8-oxodG) y la 8-hidroxiguanosina (8-oxoG) se identifican como las lesiones de oxidación más perjudiciales por su efecto mutagénico, [45] en el que esta contraparte no canónica puede emparejarse de manera errónea con ambas adenina. y citosina con la misma eficiencia. [46] [47]Este desemparejamiento provoca la alteración de la información genética mediante la síntesis de ADN y ARN. En el ARN, los niveles de oxidación se estiman principalmente mediante ensayos basados en 8-oxoG. Hasta ahora, los enfoques desarrollados para medir directamente el nivel de 8-oxoG incluyen análisis basados en HPLC y ensayos que emplean anticuerpos monoclonales anti-8-oxoG. El método basado en HPLC mide 8-oxoG con un detector electroquímico (ECD) y G total con un detector UV . [48] La relación que resulta de comparar los dos números proporciona el grado en que se oxida el G total. El anticuerpo monoclonal de ratón anti-8-oxoG se aplica ampliamente para detectar directamente este residuo en secciones de tejido o en membranas, lo que ofrece una forma más visual de estudiar su distribución en tejidos y en subconjuntos discretos de ADN o ARN. Las técnicas indirectas establecidas se basan principalmente en las consecuencias mutagénicas de esta lesión, como el ensayo lacZ. [49] Este método fue establecido y descrito por primera vez por Taddei y era una herramienta potencialmente poderosa para comprender la situación de oxidación tanto a nivel de secuencia de ARN como a nivel de nucleótido único. Otra fuente de ARN oxidados es la mala incorporación de contrapartes oxidadas de nucleótidos individuales. De hecho, el tamaño del conjunto de precursores de ARN es cientos de tamaños mayor que el del ADN.
Ha habido furiosos debates sobre si la cuestión del control de calidad del ARN existe. Sin embargo, dada la preocupación por las diferentes duraciones de las vidas medias de diversas especies de ARN, que van desde varios minutos hasta horas, la degradación del ARN defectuoso ya no puede atribuirse fácilmente a su carácter transitorio. De hecho, la reacción con ROS tarda sólo unos minutos, lo que es incluso más corto que el tiempo de vida promedio de los ARN más inestables. [41] Si a esto le sumamos el hecho de que el ARN estable ocupa la mayor parte del ARN total, la eliminación de errores de ARN se vuelve hipercrítica y ya no debe descuidarse. Esta teoría se ve confirmada por el hecho de que el nivel de ARN oxidado disminuye después de la eliminación del desafío oxidativo. [50] [51] Algunos factores potenciales incluyen ribonucleasas , que se sospecha que degradan selectivamente los ARN dañados bajo estrés. También se sabe que las enzimas que trabajan a nivel del conjunto de precursores de ARN controlan la calidad de la secuencia de ARN al cambiar el precursor erróneo a la forma que no se puede incluir directamente en la cadena naciente.