Microscopía holográfica digital

Grabado químico medido en tiempo real

Figura 1. Imagen de cambio de fase DHM de los detalles de la celda.

Medición del acabado superficial

La microscopía holográfica digital ( DHM ) es la holografía digital aplicada a la microscopía . La microscopía holográfica digital se distingue de otros métodos de microscopía por no registrar la imagen proyectada del objeto. En cambio, la información del frente de onda de luz que se origina en el objeto se registra digitalmente como un holograma , a partir del cual una computadora calcula la imagen del objeto mediante un algoritmo de reconstrucción numérica . De este modo, la lente formadora de imágenes en la microscopía tradicional se sustituye por un algoritmo informático. Otros métodos de microscopía estrechamente relacionados con la microscopía holográfica digital son la microscopía interferométrica , la tomografía de coherencia óptica y la microscopía de fase de difracción. Todos los métodos tienen en común el uso de un frente de onda de referencia para obtener información de amplitud (intensidad) y fase . La información se registra en un sensor de imagen digital o en un fotodetector a partir del cual una computadora crea (reconstruye) una imagen del objeto. En la microscopía tradicional, que no utiliza un frente de onda de referencia, sólo se registra información de intensidad y se pierde información esencial sobre el objeto.

La holografía fue inventada por Dennis Gabor para mejorar la microscopía electrónica . ^[1] Sin embargo, nunca encontró muchas aplicaciones concretas e industriales en este campo.

En realidad, el DHM se ha aplicado principalmente a la microscopía óptica. En este campo, ha mostrado aplicaciones únicas para la caracterización 3D de muestras técnicas y permite la caracterización cuantitativa de células vivas. En ciencia de materiales , DHM se utiliza habitualmente para investigaciones en laboratorios académicos e industriales. Dependiendo de la aplicación, los microscopios se pueden configurar tanto para fines de transmisión como de reflexión. DHM es una solución única para la caracterización 4D (3D + tiempo) de muestras técnicas, cuando es necesario adquirir información en un intervalo de tiempo corto. Es el caso de mediciones en ambientes ruidosos, en presencia de vibraciones, cuando las muestras se mueven o cuando la forma de las muestras cambia debido a estímulos externos, como fuerzas mecánicas, eléctricas o magnéticas, erosión química o deposición y evaporación. En ciencias biológicas, DHM suele configurarse en modo de transmisión. Esto permite la medición de fase cuantitativa (QPM) sin etiquetas, también llamada imagen de fase cuantitativa (QPI), de células vivas. Las mediciones no afectan a las células, lo que permite estudios a largo plazo. Proporciona información que puede interpretarse en muchos procesos biológicos subyacentes, como se explica en la sección "Imágenes de células vivas" a continuación.

Principio de funcionamiento

Figura 2. Configuración óptica típica de DHM.

Para crear el patrón de interferencia necesario , es decir, el holograma, la iluminación debe ser una fuente de luz coherente (monocromática), por ejemplo un láser . Como se puede ver en la Figura 2, la luz láser se divide en un haz de objeto y un haz de referencia. El haz del objeto expandido ilumina la muestra para crear el frente de onda del objeto. Después de que el objetivo del microscopio recoge el frente de onda del objeto , los frentes de onda del objeto y de referencia se unen mediante un divisor de haz para interferir y crear el holograma. Utilizando el holograma grabado digitalmente, una computadora actúa como una lente digital y calcula una imagen visible del frente de onda del objeto mediante un algoritmo de reconstrucción numérica.

Comúnmente, se utiliza un objetivo de microscopio para recolectar el frente de onda del objeto. Sin embargo, como el objetivo del microscopio sólo se utiliza para recoger luz y no para formar una imagen, puede sustituirse por una simple lente. Si se acepta una resolución óptica ligeramente inferior, el objetivo del microscopio se puede retirar por completo.

La holografía digital viene en diferentes versiones, como Fresnel fuera de eje , Fourier , plano de imagen , en línea , Gabor y holografía digital con desplazamiento de fase , ^[2] dependiendo de la configuración óptica. El principio básico, sin embargo, es el mismo; Se graba un holograma y una computadora reconstruye una imagen.

La resolución óptica lateral de la microscopía holográfica digital es equivalente a la resolución de la microscopía óptica tradicional . DHM está limitada por la difracción por la apertura numérica , de la misma manera que la microscopía óptica tradicional. Sin embargo, DHM ofrece una resolución axial (profundidad) excelente. Se ha informado de una precisión axial de aproximadamente 5 nm. ^[3]

Ventajas

Figura 3. Comparación de una imagen de cambio de fase DHM (izquierda) y una imagen de microscopía de contraste de fase (derecha).

Imágenes de cambio de fase Además de la imagen de campo brillante
normal , también se crea una imagen de cambio de fase . La imagen de cambio de fase es única para la microscopía holográfica digital y proporciona información cuantificable sobre la distancia óptica . En la reflexión DHM, la imagen de cambio de fase forma una imagen topográfica del objeto.

Los objetos transparentes, como las células biológicas vivas , se observan tradicionalmente en un microscopio de contraste de fases o en un microscopio de contraste de interferencia diferencial . Estos métodos visualizan objetos transparentes con cambio de fase distorsionando la imagen del campo brillante con información de cambio de fase. En lugar de distorsionar la imagen del campo brillante, la transmisión DHM crea una imagen de cambio de fase separada que muestra el espesor óptico del objeto. La microscopía holográfica digital permite visualizar y cuantificar objetos transparentes y, por lo tanto, también se denomina microscopía cuantitativa de contraste de fases .

Las imágenes tradicionales de contraste de fase o de campo brillante de células biológicas vivas sin teñir, Figura 3 (derecha), han demostrado ser muy difíciles de analizar con software de análisis de imágenes . Por el contrario, las imágenes de cambio de fase, Figura 3 (izquierda), se segmentan y analizan fácilmente mediante un software de análisis de imágenes basado en morfología matemática , como CellProfiler . ^[4]

Información tridimensional
La imagen de un objeto se calcula a una distancia focal determinada . Sin embargo, como el holograma grabado contiene toda la información necesaria del frente de onda del objeto, es posible calcular el objeto en cualquier plano focal cambiando el parámetro de distancia focal en el algoritmo de reconstrucción. De hecho, el holograma contiene toda la información necesaria para calcular una pila de imágenes completa . En un sistema DHM, donde el frente de onda del objeto se registra desde múltiples ángulos, es posible caracterizar completamente las características ópticas del objeto y crear imágenes tomográficas del objeto. ^{[5] [6]}

Enfoque automático digital El enfoque automático
convencional se logra cambiando verticalmente la distancia focal hasta encontrar un plano de imagen enfocado. Como la pila completa de planos de imagen se puede calcular a partir de un único holograma, es posible utilizar cualquier método de enfoque automático pasivo para seleccionar digitalmente el plano focal. ^[7] Las capacidades de enfoque automático digital de la holografía digital abren la posibilidad de escanear y obtener imágenes de superficies extremadamente rápidamente, sin ningún movimiento mecánico vertical. Al grabar un solo holograma y luego unir subimágenes calculadas en diferentes planos focales, se puede crear una imagen completa y enfocada del objeto. ^[8]

Corrección de aberraciones ópticas
Como los sistemas DHM no tienen una lente formadora de imágenes, las aberraciones ópticas tradicionales no se aplican a DHM. Las aberraciones ópticas se "corrigen" mediante el diseño del algoritmo de reconstrucción. Un algoritmo de reconstrucción que realmente modele la configuración óptica no sufrirá aberraciones ópticas. ^{[9] [10]}

Bajo coste
En los sistemas de microscopía óptica , las aberraciones ópticas se corrigen tradicionalmente combinando lentes en un objetivo de microscopio formador de imágenes complejo y costoso. Además, la estrecha profundidad focal con grandes aumentos requiere una mecánica de precisión. Los componentes necesarios para un sistema DHM son componentes ópticos y semiconductores económicos, como un diodo láser y un sensor de imagen . El bajo coste de los componentes, en combinación con las capacidades de enfoque automático del DHM, hacen posible fabricar sistemas DHM a un coste muy bajo. ^{[11] [12]}

Aplicaciones

Figura 4. Imagen de cambio de fase DHM de glóbulos rojos humanos .

La microscopía holográfica digital se ha aplicado con éxito en diversas áreas de aplicación. ^[13]

Imágenes de células vivas

Sin embargo, debido a la capacidad del DHM de visualizar y cuantificar tejido biológico de forma no invasiva, las aplicaciones biomédicas han recibido mayor atención. ^[14] Ejemplos de aplicaciones biomédicas son:

• "Recuento de células sin etiquetas en cultivos de células adherentes ". La microscopía holográfica digital permite realizar el recuento de células y medir la viabilidad celular directamente en la cámara de cultivo celular. ^{[15] [16]} Hoy en día, los métodos de recuento de células más utilizados, el hemocitómetro o el contador Coulter , solo funcionan con células que están en suspensión.
• Análisis de viabilidad sin etiquetas de cultivos celulares adherentes. ^{[17] [18]} La holografía digital se ha utilizado para estudiar el proceso apoptótico en diferentes tipos de células. Los cambios del índice de refracción que tienen lugar durante el proceso apoptótico se miden fácilmente con DHM.
• Análisis del ciclo celular sin etiquetas . Se ha demostrado que el cambio de fase inducido por las células está correlacionado con la masa seca celular. La masa seca celular se puede combinar con otros parámetros que se pueden obtener mediante holografía digital, como el volumen celular y el índice de refracción, para proporcionar una mejor comprensión del ciclo celular. ^[19]
• Análisis de morfología de células sin etiquetas. La holografía digital se ha utilizado en diferentes contextos para estudiar la morfología celular sin tinción ni etiquetado. ^[16] Esto se puede utilizar para seguir procesos como el proceso de diferenciación donde cambian las características celulares. DHM también se ha utilizado para el seguimiento automatizado de células madre vegetales y permitió distinguir entre dos tipos de células madre midiendo parámetros morfológicos. ^[20]
• Estudios de células nerviosas sin etiquetas . La microscopía holográfica digital permite estudiar procesos no perturbados en las células nerviosas, ya que no es necesario marcarlos. ^[21] La hinchazón y el cambio de forma de las células nerviosas causados ​​por el desequilibrio celular se estudiaron fácilmente.

Figura 5. Lapso de tiempo de células no teñidas, en división y en migración.

• Análisis de alto contenido sin etiquetas . El análisis/detección de fluorescentes de alto contenido tiene varios inconvenientes. Por tanto, se han propuesto alternativas sin etiquetas basadas en imágenes de cambio de fase. ^[4] La capacidad de DHM para obtener imágenes de cambio de fase rápidamente en grandes áreas abre nuevas posibilidades de caracterización cuantitativa muy rápida del ciclo celular y los efectos de agentes farmacológicos específicos.
• Análisis de glóbulos rojos . Se han utilizado imágenes de cambio de fase para estudiar la dinámica de los glóbulos rojos. ^{[22] [23]} El volumen de glóbulos rojos y la concentración de hemoglobina se midieron combinando información de imágenes de absorción y cambio de fase para facilitar el recuento completo de células sanguíneas mediante microscopía holográfica. ^[24] Además, se ha demostrado ^[25] que la información de cambio de fase discrimina los glóbulos rojos inmaduros de los maduros, lo que facilita el recuento de reticulocitos sin teñir .
• Citometría de flujo y seguimiento y caracterización de partículas. Las imágenes creadas mediante holografía digital se calculan a partir del holograma grabado en cualquier momento después de la grabación real y en cualquier plano focal determinado. Combinando varias imágenes calculadas a partir del mismo holograma, pero en diferentes planos focales,se puede obtener una mayor profundidad de campo , muy superior a la que se puede lograr con la microscopía óptica tradicional. La mayor profundidad de campo permite obtener imágenes y caracterizar la morfología de células y partículas mientras están en suspensión. Las observaciones pueden realizarse directamente en un canal de microfluidos o estáticamente en una cámara de observación. ^{[26] [27] [28]}
• Microscopía de lapso de tiempo de división y migración celular. ^[29] Las capacidades de imágenes de cambio de fase y enfoque automático de la microscopía holográfica digital hacen posible crear sin esfuerzo videoclips de lapso de tiempo cuantificables y sin etiquetas de células no teñidas para estudios de migración celular . ^[30] En la Figura 5 se muestra un lapso de tiempo sin etiquetas de células en división y migración.
• Estudios de tomografía . ^[31] La microscopía holográfica digital permite un análisis cuantificable y sin etiquetas del movimiento subcelular en las profundidades del tejido vivo.

Topografía 3D de superficie

DHM realiza mediciones estáticas de topografía de superficies 3D como muchos otros perfilómetros ópticos 3D (interferómetros de luz blanca, confocales, variación de enfoque,...). Permite recuperar la rugosidad y la forma de muchas superficies. ^{[32] [33] [34]} El uso de múltiples longitudes de onda permite superar el límite de 1/4 de los interferómetros de desplazamiento de fase tradicionales. Se han demostrado aplicaciones en muchas muestras, como implantes médicos, componentes de relojes, microcomponentes y microópticas. ^[35]

Solicitudes resueltas en el tiempo

Superficie autorreparable que se recupera de un rasguño: medición en tiempo real

Como DHM mide la topografía de la superficie 3D en todo el campo de visión con una sola adquisición de cámara, no hay necesidad de escanear, ni vertical ni lateral. En consecuencia, los cambios dinámicos de topografía se miden instantáneamente. La tasa de adquisición sólo está limitada por el marco de la cámara. Se han demostrado mediciones en muchos tipos de muestras, como superficies inteligentes, superficies autorreparables, sistemas sin equilibrio, procesos de evaporación, electrodeposición, evaporación, cristalización, deformación mecánica, etc. ^{[36] [37]}

MEMS

Transductores ultrasónicos medidos a 8 MHz en modo estroboscópico

Utilizándose junto con una unidad electrónica estroboscópica para sincronizar el pulso láser para la iluminación de la muestra y la adquisición de la cámara con la excitación MEMS, DHM® proporciona secuencias de tiempo de topografía 3D a lo largo de la fase de excitación de los microsistemas. El análisis de esta secuencia temporal de topografías 3D adquiridas a una frecuencia fija proporciona un mapa de vibraciones y permite la descomposición del movimiento en términos de dentro y fuera del plano. ^[38]

El barrido de la frecuencia de excitación proporciona resonancias estructurales, así como análisis de Bode de amplitud y fase. ^[39] Se han demostrado mediciones en muchos tipos de MEMS, como actuadores de peine, microespejos, acelerómetros, giroscopios, microbombas, micrófonos, transductores ultrasónicos, voladizos y ondas acústicas de superficie, entre otros. ^{[40] [41] [42] [43] [44] [45] [46]}

Metrología

DHM se refiere únicamente a longitudes de onda para medir la altura. Por lo tanto, DHM proporciona mediciones de altura precisas con muy alta repetibilidad y linealidad independientemente de cualquier calibración vertical, posicionamiento preciso de la pieza mecánica, repetibilidad del controlador piezométrico interferométrico, desplazamiento motorizado o escaneo de pantalla de cristal líquido. Esta característica convierte a DHM en una excelente herramienta para la certificación de pasos y rugosidad, entre otras. Para los sistemas de transmisión, la calibración de planitud perfecta se logra tomando como referencia una adquisición sin ninguna muestra en el camino óptico. La calibración de planitud de sistemas de tipo reflexión requiere el uso de una muestra perfectamente plana. ^[47]

inspección industrial

Medición automática de prótesis de cadera: caracterización de la rugosidad de la superficie.

El muy corto tiempo necesario para capturar información hace que DHM sea muy resistente a las vibraciones ambientales. Permite, en particular, controles de calidad de las piezas “en vuelo” y “en línea”. Se han demostrado aplicaciones en particular para la rugosidad de implantes, la estructura de componentes semiconductores, la industria solar, la metrología industrial y las piezas de relojes, entre otros. ^{[48] ​​[49]}

Microóptica

Se ha demostrado y comparado con éxito la medición e inspección rápidas de conjuntos de microópticas con mediciones realizadas con otros perfilómetros. ^{[50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58]}

Los algoritmos de profundidad de enfoque extendidos basados ​​en la focalización digital permiten tener un enfoque nítido en toda la superficie de la lente, incluso para muestras con alta NA. ^[59] DHM también se ha aplicado a la caracterización dinámica de lentes variables. ^[53]

Seguimiento de partículas en 3D

El seguimiento de partículas en 3D se ha demostrado en numerosas publicaciones [por completar]. Se puede reconstruir digitalmente una pila Z de mediciones a partir de un único holograma utilizando un rango de distancias de propagación. Algoritmos específicos permiten determinar para cada partícula la distancia correspondiente a su mejor enfoque. Realizar esta operación en una secuencia temporal de hologramas permite determinar las trayectorias de las partículas.

Historia

Los primeros informes sobre la sustitución del holograma fotográfico de la holografía clásica por el registro digital del holograma y la reconstrucción numérica de la imagen en un ordenador se publicaron a finales de los años sesenta ^[60] y principios de los setenta. ^{[61] [62]} Se propusieron ideas similares para el microscopio electrónico a principios de la década de 1980. ^[63] Pero las computadoras eran demasiado lentas y las capacidades de grabación eran demasiado pobres para que la holografía digital fuera útil en la práctica. Después del entusiasmo inicial, la holografía digital entró en una hibernación similar a la que había experimentado la holografía unas dos décadas antes. (Nótese que en la década de 1960, "holografía digital" podía significar calcular una imagen a partir de un holograma o calcular un holograma a partir de un modelo 3D. Este último se desarrolló en paralelo con la holografía clásica durante la pausa, y durante ese tiempo, la "holografía digital" Holografía" era sinónimo de lo que ahora se conoce como holografía generada por computadora ).

A mediados de la década de 1990, los sensores de imágenes digitales y las computadoras se habían vuelto lo suficientemente potentes como para reconstruir imágenes con cierta calidad, ^[64] pero aún carecían del número de píxeles y la densidad necesarios para que la holografía digital fuera algo más que una curiosidad. En ese momento, el mercado que impulsaba los sensores de imagen digitales era principalmente video de baja resolución, por lo que esos sensores solo proporcionaban resolución PAL , NTSC o SECAM . Esto cambió repentinamente a principios del siglo XXI con la introducción de las cámaras digitales de imágenes fijas , que impulsaron la demanda de sensores económicos con un alto número de píxeles. A partir de 2010, los sensores de imagen asequibles pueden tener hasta 60 megapíxeles. Además, el mercado de reproductores de CD y DVD ha impulsado el desarrollo de ópticas y láseres de diodo asequibles .

Los primeros informes sobre el uso de la holografía digital para microscopía óptica llegaron a mediados de la década de 1990. ^{[65] [66]} Sin embargo, no fue hasta principios de la década de 2000 que la tecnología de sensores de imagen había progresado lo suficiente como para permitir imágenes de una calidad razonable. Durante este tiempo, se fundaron las primeras empresas comerciales de microscopía holográfica digital. Con una mayor potencia informática y el uso de sensores y láseres de alta resolución económicos, la microscopía holográfica digital hoy encuentra aplicaciones principalmente en las ciencias biológicas, la oceanología y la metrología .

Ver también

• holografía digital
• microscopía cuantitativa de contraste de fases
• Interferometría holográfica
• holotomografía
• holografía
• microscopía

Referencias

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enlaces externos

• Encuentro de Holografía Digital e Imágenes Tridimensionales por The Optical Society

Otras lecturas

Libros

• Métodos de holografía digital por LP Yaroslavskii y NS Merzlyakov, Springer (1980)
• Holografía digital y procesamiento de imágenes digitales: principios, métodos y algoritmos por Leonid Yaroslavsky, Kluwer (2004)
• Manual de interferometría holográfica: métodos ópticos y digitales de Thomas Kreis, Wiley (2004)
• Holografía digital de U. Schnars y W. Jueptner, Springer (2005)
• Holografía digital y visualización tridimensional: principios y aplicaciones por Ting-Chung Poon (Editor), Springer (2006)
• Aplicaciones de microscopía de holografía digital: análisis y seguimiento de objetos tridimensionales por Cedric Schockaert, VDM Verlag (2009)
• Microscopía holográfica de objetos microscópicos de fase: teoría y práctica por Tatyana Tishko, Tishko Dmitry, Titar Vladimir, World Scientific (2010)
• Imágenes de fase cuantitativa de células y tejidos por Gabriel Popescu, McGraw-Hill (2011)
• Microscopía holográfica digital: principios, técnicas y aplicaciones por Myung K. Kim, Springer (2011)
• Microscopía de luz coherente: imágenes y análisis de fase cuantitativo editado por Pietro Ferraro, Springer (2011)
• Holografía digital para MEMS y metrología de microsistemas editado por Erdal Cayirci, Wiley (2011)
• Procesamiento de imágenes para holografía digital por Karen Molony, VDM Verlag (2011)
• Holografía digital de Pascal Picart y Jun-chang Li, Wiley (2012)

Reseñas

• General: Kim Myung K (2010). "Principios y técnicas de microscopía holográfica digital". Revista de Fotónica para la Energía . 1 : 018005. Código Bib : 2010SPIER...1a8005K. doi : 10.1117/6.0000006 .

Problemas de funciones

• HOLOGRAFÍA DIGITAL E IMÁGENES 3D editado por Ting-Chung Poon, Applied Optics vol. 50, edición. 34 (2011)