Un microportador es una matriz de soporte que permite el crecimiento de células adherentes en biorreactores . En lugar de sobre una superficie plana, las células se cultivan sobre la superficie de microportadores esféricos de modo que cada partícula transporta varios cientos de células y, por lo tanto, la capacidad de expansión se puede multiplicar varias veces. [1] Proporciona una forma sencilla de ampliar los sistemas de cultivo para la producción industrial de terapias basadas en células o proteínas , o para fines de investigación. [2] [3]
Estas matrices esféricas sólidas o porosas tienen un diámetro que varía entre 100 y 300 um para permitir una superficie suficiente y al mismo tiempo mantener suficiente adhesión y soporte celular, y su densidad es mínimamente superior a la del agua (1 g/ml) para que permanezcan en suspensión en un tanque agitado. [1] [4] Pueden estar compuestas de materiales sintéticos como la acrilamida o de materiales naturales como la gelatina. [2] [3]
Las ventajas de la tecnología de microportadores en la industria biotecnológica incluyen (a) facilidad de ampliación, (b) capacidad de controlar con precisión las condiciones de crecimiento celular en biorreactores sofisticados controlados por computadora, (c) una reducción general en el espacio de planta y el volumen de la incubadora necesarios para una operación de fabricación de tamaño determinado, (d) una reducción drástica en la mano de obra técnica y (e) un entorno más natural para el cultivo celular que promueve la diferenciación. [5]
Existen varios tipos de microportadores que pueden utilizarse, cuya selección es crucial para un rendimiento óptimo de la aplicación. Al principio de la historia del desarrollo de microportadores, se utilizaban abrumadoramente materiales sintéticos, ya que permitían un fácil control de las propiedades mecánicas y resultados reproducibles para la evaluación de su rendimiento. [3] Estos materiales incluyen DEAE-dextrano, vidrio, plástico de poliestireno y acrilamida . [3] En 1967, el desarrollo de microportadores comenzó cuando van Wezel descubrió que el material podía soportar el crecimiento de células dependientes del anclaje, y utilizó microportadores de dietilaminoetil-Sephadex. [3] Sin embargo, los polímeros sintéticos impiden suficientes interacciones celulares con su entorno y atrofian su crecimiento. [4] Las células pueden no diferenciarse adecuadamente sin la retroalimentación de su entorno, y los niveles de unión serían bajos. [3] Por lo tanto, la segunda generación del desarrollo de microportadores implica el uso de polímeros naturales como la gelatina , el colágeno , la quitina y sus derivados, y la celulosa . [2] Estos materiales no sólo se obtienen fácilmente, sino que además los materiales naturales proporcionan sitios de unión para las células y un microambiente similar que proporciona las vías de señalización celular necesarias para su adecuada diferenciación. [3] Además, como son biocompatibles, la suspensión resultante se puede utilizar para la administración de terapias celulares in vivo . [1]
Aunque se han desarrollado microportadores líquidos, una gran mayoría de los microportadores disponibles comercialmente son partículas sólidas, sintetizadas a través de polimerización en suspensión . [3] Sin embargo, las células cultivadas en microportadores sólidos corren el riesgo de sufrir daños por fuerzas externas y colisiones con otras partículas y el tanque. [4] Por lo tanto, se deben tomar precauciones adicionales al determinar la velocidad y el mecanismo de agitación, de modo que las fuerzas dinámicas de fluidos resultantes no sean lo suficientemente fuertes como para afectar negativamente al cultivo. [4] [3] El desarrollo de microportadores porosos amplió enormemente las capacidades de esta tecnología, ya que aumentó aún más el número de células que el material puede contener, pero lo que es más importante, protegió a las que estaban dentro de la partícula de las fuerzas externas. [3] Estas incluyen fuerzas de arrastre y fricción del fluido de suspensión, gradientes de presión y tensiones de corte . [1] La década de 1980 estuvo marcada por una ola de desarrollo de microportadores con el avance de las partículas porosas. [4]
Los microportadores del mismo material pueden diferir en su porosidad, gravedad específica , propiedades ópticas, presencia de componentes animales y químicas de superficie. [4] Las químicas de superficie pueden incluir proteínas de la matriz extracelular, grupos funcionales , proteínas recombinantes, péptidos y moléculas cargadas positiva o negativamente, agregadas a través de conjugación , copolimerización , tratamiento con plasma o injerto. [3] Estos pueden servir para proporcionar niveles más altos de adhesión de las células a las partículas, proporcionar una liberación controlada para el aislamiento o hacer que las partículas sean más resistentes térmica y físicamente, entre otras razones. [3]
Existen varios tipos de microportadores disponibles comercialmente, incluidos los basados en alginato (GEM, Global Cell Solutions), dextrano (Cytodex, GE Healthcare ), colágeno (Cultispher, Percell) y poliestireno (SoloHill Engineering). [5]
Una ventaja destacada del uso de suspensiones de microportadores para el cultivo de células en comparación con las placas bidimensionales tradicionales es su capacidad para contener más células en volúmenes más pequeños. [1] [6] Un sello distintivo del protocolo habitual de laboratorio de cultivo celular es el paso continuo a medida que las células alcanzan la confluencia en las placas con bastante rapidez, un cuello de botella en la producción de productos biológicos. [1] Los recipientes multicapa, las placas apiladas, las fibras huecas y los reactores de lecho compacto fueron otras tecnologías desarrolladas para combatir este límite de capacidad en el cultivo celular en placa [1] . [2] Aunque fueron una mejora, la cantidad de células producidas a través de estos métodos todavía no alcanzó el umbral para aplicaciones clínicas. [2] Sin embargo, el cultivo celular con microportadores fue el avance necesario para que el cultivo celular alcanzara importancia industrial y clínica. [2] Los estudios han demostrado que las suspensiones de microportadores, en comparación con el cultivo en recipientes multicapa, mejoran el rendimiento celular en 80 veces con solo el diez por ciento del espacio de las Buenas Prácticas de Fabricación y solo el sesenta por ciento del costo original. [4] Sin la necesidad de un paso continuo, hay menos riesgo de contaminación bacteriana y también se minimizan los costos laborales. [2]
El cultivo bidimensional también sufre de una pobre difusividad de nutrientes y gases, requiriendo que los medios y suplementos agregados sean distribuidos uniformemente de manera manual, y puede resultar en datos irreproducibles. [1] [2] Las suspensiones de células microportadoras en biorreactores de tanque agitado permiten una distribución uniforme a través de una agitación homogénea. [1] Parámetros como el pH, la presión de oxígeno y las concentraciones de suplementos de medios pueden ser monitoreados continuamente dentro de un biorreactor en lugar de probar manualmente pequeñas muestras de placas. [2] Sin embargo, altas velocidades de agitación pueden causar colisiones dañinas entre partículas y contra el reactor, y una velocidad demasiado baja puede inhibir el crecimiento celular al causar una acumulación de partículas en una "zona muerta" y prevenir una distribución uniforme de nutrientes esenciales. [1] [4] Por lo tanto, se deben calcular gradientes de velocidad mínima y máxima para mantener la suspensión homogénea pero también protegida de fuerzas innecesarias. [2] [6] A menudo, el mecanismo más eficiente para esto es un agitador axial dentro del biorreactor, que permite una mezcla eficiente a velocidades de agitación mínimas. [4] La naturaleza homogénea de los biorreactores que funcionan bien también permite procedimientos de muestreo y monitoreo simples, en comparación con el cultivo bidimensional que a menudo sufre de procedimientos de muestreo tediosos. [4] [2] [6]
Además, el entorno de suspensión tridimensional y de alta densidad promueve la morfología y diferenciación celular natural a través de la estimulación mecánica. [1] Por otro lado, el cultivo en placa bidimensional tiende a desdiferenciar las células en varios pasajes y, por lo tanto, el número total de pasajes debe ser limitado. [1]
Las suspensiones de microportadores también se pueden ampliar fácilmente, mediante mayores concentraciones de micropartículas en reactores de tanque agitado más grandes, mientras que el espacio de laboratorio utilizado para el cultivo se puede mantener al mínimo. [2] Sin embargo, una ampliación de la plataforma de microportadores también implica ciertos desafíos en el proceso de producción posterior. [4] Esto incluye una reelaboración de los procesos de desprendimiento y aislamiento de células. [4] Se deben extraer volúmenes mayores de líquido de suspensión de tanques más grandes de biorreactores y, por lo tanto, se debe comprar más equipo para manejar decenas a cientos de litros de solución en lugar del mililitro estándar. [4]
Se están investigando los microtransportadores para transportar células a objetivos de ingeniería tisular. [3] Se han transportado con éxito hepatocitos, condrocitos, fibroblastos y más utilizando microtransportadores biocompatibles a objetivos in vivo para la reparación de tejidos dañados. [1] Los microtransportadores también se pueden utilizar para transportar pequeñas moléculas y proteínas con el mismo propósito. [5]
P. Chen et al. desarrollaron un método de ensamblaje basado en líquido para ensamblar microportadores sembrados con células en diversas estructuras. Se ensamblaron microportadores sembrados con neuronas para la formación de redes neuronales 3D con forma global controlada. Este método es potencialmente útil para la ingeniería de tejidos y la neurociencia . [7]