Las lisinas , también conocidas como endolisinas o hidrolasas de mureína , son enzimas hidrolíticas producidas por bacteriófagos para escindir la pared celular del huésped durante la etapa final del ciclo lítico . Las lisinas son enzimas altamente evolucionadas que pueden dirigirse a uno de los cinco enlaces del peptidoglicano (mureína), el componente principal de las paredes celulares bacterianas, lo que permite la liberación de viriones progenie de la célula lisada. Las arqueas que contienen paredes celulares también son lisadas por lisinas especializadas en escisión de pseudomureína , [2] mientras que la mayoría de los virus arqueológicos emplean mecanismos alternativos. [3] De manera similar, no todos los bacteriófagos sintetizan lisinas: algunos pequeños fagos de ADN y ARN monocatenarios producen proteínas de membrana que activan los mecanismos autolíticos del huésped , como las autolisinas . [4]
Las lisinas se utilizaron por primera vez con fines terapéuticos en 2001 en el laboratorio Fischetti (ver más abajo) y ahora se utilizan como agentes antibacterianos debido a su alta eficacia y especificidad en comparación con los antibióticos , que son susceptibles a la resistencia bacteriana. [5] Debido a que las lisinas son esenciales para la supervivencia de los bacteriófagos, la resistencia a las lisinas es un evento extremadamente raro. Durante los más de 20 años de desarrollo de las lisinas como terapias, no se ha observado resistencia, incluso cuando la resistencia es forzada por experimentos de mutagénesis.
Las lisinas de fagos de ADN de doble cadena tienden a estar en el rango de 25 a 40 kDa en términos de tamaño. Una excepción notable es la endolisina PlyC estreptocócica, que tiene 114 kDa. PlyC no solo es la lisina más grande y potente, sino que también es estructuralmente única, ya que está compuesta de dos productos génicos diferentes, PlyCA y PlyCB, con una proporción de ocho subunidades PlyCB por cada PlyCA en su conformación activa. [6]
Todas las demás lisinas son monoméricas y comprenden dos dominios separados por una región de enlace corta. En el caso de las lisinas de bacterias grampositivas, el dominio N-terminal cataliza la hidrólisis del peptidoglicano, mientras que el dominio C-terminal se une al sustrato de la pared celular.
El dominio catalítico es responsable de la ruptura de los enlaces de peptidoglicano. Funcionalmente, se pueden distinguir cinco tipos de dominio catalítico de lisina:
El peptidoglicano está formado por aminoácidos y azúcares reticulados que forman aminoazúcares alternados: N-acetilglucosamina (NAG) y ácido N-acetilmurámico (NAM). Las lisinas de la endo-β-N-acetilglucosaminidasa escinden las NAG, mientras que las lisinas de la N-acetilmuramidasa (lisinas similares a la lisozima) escinden las NAM. Las lisinas de la endopeptidasa escinden cualquiera de los enlaces peptídicos entre aminoácidos, mientras que las lisinas de la N-acetilmuramoil-l-alanina amidasa (o simplemente lisinas amidasa) hidrolizan el enlace amida entre el azúcar y las fracciones de aminoácidos. Por último, las lisinas de la γ-d-glutaminil-l-lisina endopeptidasa descubiertas recientemente escinden el enlace gamma entre los residuos de D-glutamina y L-lisina. Como es el caso de las autolisinas , la confusión inicial en torno a la especificidad de escisión de estas enzimas individuales ha llevado a algunas atribuciones erróneas del nombre "lisozima" a proteínas sin esta actividad. [7]
Por lo general, dos o más dominios catalíticos diferentes están unidos a un único dominio de unión celular. Esto es típico en muchas lisinas estafilocócicas, así como en la holoenzima PlyC estreptocócica, que contiene dos dominios catalíticos. [6] [8] Los dominios catalíticos están altamente conservados en las lisinas de fagos de la misma clase. [5]
El dominio de unión celular (CBD) se une a un sustrato específico que se encuentra en la pared celular de la bacteria huésped, generalmente un carbohidrato. A diferencia del dominio catalítico, el dominio de unión celular es variable, lo que permite una gran especificidad y disminuye la resistencia bacteriana. [9] La afinidad de unión al sustrato de la pared celular tiende a ser alta, posiblemente para secuestrar en fragmentos de la pared celular cualquier enzima libre, que podría competir con la progenie del fago para evitar infectar a las bacterias huésped adyacentes. [10]
Se ha propuesto que el principal mecanismo de evolución de las lisinas de fagos es el intercambio de unidades modulares, un proceso por el cual se han intercambiado diferentes dominios catalíticos y de unión celular entre lisinas, lo que habría dado lugar a nuevas combinaciones de especificidades catalíticas y de unión bacteriana. [11]
El dominio catalítico de la lisina digiere el peptidoglicano localmente a una velocidad elevada, lo que provoca agujeros en la pared celular. Dado que la pared celular de peptidoglicano reticulado es el único mecanismo que impide la explosión espontánea de células bacterianas debido a la alta presión interna (3 a 5 atmósferas), la digestión enzimática por lisinas provoca irreversiblemente una lisis hipotónica. Teóricamente, debido a las propiedades catalíticas de las lisinas de los fagos, una sola enzima sería suficiente para matar a la bacteria huésped cortando el número necesario de enlaces, aunque esto todavía no se ha demostrado. [5] El trabajo de Loessner et al. sugiere que la escisión se consigue normalmente mediante la acción conjunta de múltiples moléculas de lisina en una región local de la pared celular del huésped. [10] La alta afinidad de unión al sustrato de la pared celular (cercana a la de la IgG por su sustrato) de cada lisina parece ser la razón por la que se requieren múltiples moléculas, ya que cada lisina se une tan fuertemente a la pared celular que no puede romper suficientes enlaces para causar lisis por sí misma. [10]
Para llegar a la pared celular, las lisinas de los fagos deben atravesar la membrana celular. Sin embargo, generalmente carecen de un péptido señal que les permita hacerlo. Para resolver este problema, los virus fagos sintetizan otra proteína llamada holina que se une a la membrana celular y hace agujeros en ella (de ahí su nombre), lo que permite que las lisinas alcancen la matriz de peptidoglicano. La holina prototípica es la proteína S del fago lambda, que asiste a la proteína R del fago lambda (lisina). Todas las holinas se incrustan en la membrana celular y contienen al menos dos dominios helicoidales transmembrana. Se cree que el proceso de formación de agujeros se logra mediante la oligomerización de la holina en un momento específico cuando se establece la liberación de los viriones de la progenie. [4] [12]
Las lisinas de los fagos son generalmente específicas de una especie o subespecie, lo que significa que solo son efectivas contra las bacterias a partir de las cuales fueron producidas. Mientras que algunas lisinas solo actúan sobre las paredes celulares de varios filotipos bacterianos, se han encontrado algunas lisinas de amplio espectro. [13] De manera similar, se conocen algunas lisinas termoestables, lo que las hace más fáciles de usar en biotecnología. [14] En cuanto a su uso como agentes antibacterianos, se ha encontrado que las lisinas son efectivas principalmente contra bacterias Gram-positivas , ya que las bacterias Gram-negativas poseen una membrana externa que evita que las moléculas de lisina extracelulares digieran el peptidoglicano. [5] Sin embargo, las lisinas con actividad contra bacterias Gram-negativas, como OBPgp279 , han despertado interés como posibles terapias. [15]
Uno de los aspectos más problemáticos del uso de las lisinas de los fagos como agentes antimicrobianos es la inmunogenicidad potencial de estas enzimas. A diferencia de la mayoría de los antibióticos, las proteínas son propensas al reconocimiento y la unión de anticuerpos, lo que significa que las lisinas podrían ser ineficaces al tratar infecciones bacterianas o incluso peligrosas, lo que podría conducir a una respuesta inmunitaria sistémica o una tormenta de citocinas . No obstante, los datos experimentales del suero de conejo inmunológicamente rico mostraron que el suero hiperinmune ralentiza pero no bloquea la actividad de la lisina neumocócica Cpl-1. [16]
Las lisinas de fagos se han probado con éxito en modelos animales para controlar las bacterias patógenas resistentes a los antibióticos que se encuentran en las membranas mucosas y en la sangre. La principal ventaja de las lisinas en comparación con los antibióticos no es solo la baja resistencia bacteriana, sino también la alta especificidad hacia el patógeno objetivo y la baja actividad hacia la flora bacteriana normal del huésped . [5]
Las lisinas se utilizaron por primera vez con fines terapéuticos en animales en 2001, en una publicación en la que ratones colonizados por vía oral con Streptococcus pyogenes fueron descolonizados con una dosis única de lisina PlyC administrada por vía oral. [17]
