La lisozima ( EC 3.2.1.17, muramidasa, N -acetilmuramida glicanhidrolasa ; nombre sistemático peptidoglicano N -acetilmuramoilhidrolasa ) es una enzima antimicrobiana producida por animales que forma parte del sistema inmunológico innato . Es una glucósido hidrolasa que cataliza el siguiente proceso:
El peptidoglicano es el componente principal de la pared celular de las bacterias grampositivas . [1] Esta hidrólisis a su vez compromete la integridad de las paredes celulares bacterianas provocando la lisis de las bacterias.
La lisozima es abundante en las secreciones , incluidas las lágrimas , la saliva , la leche humana y la mucosidad . También está presente en los gránulos citoplasmáticos de los macrófagos y los neutrófilos polimorfonucleares (PMN). Se pueden encontrar grandes cantidades de lisozima en la clara de huevo . Las lisozimas de tipo C están estrechamente relacionadas con la α-lactoalbúmina en secuencia y estructura, lo que las convierte en parte de la misma familia de glucósidos hidrolasas 22 . [2] En los seres humanos, la enzima lisozima tipo C está codificada por el gen LYZ . [3] [4]
La lisozima de clara de huevo de gallina es térmicamente estable, con un punto de fusión que alcanza hasta 72 °C a un pH de 5,0. [5] Sin embargo, la lisozima en la leche humana pierde actividad muy rápidamente a esa temperatura. [6] La lisozima de clara de huevo de gallina mantiene su actividad en un amplio rango de pH (6-9). [7] Su punto isoeléctrico es 11,35. [8] El punto isoeléctrico de la lisozima de la leche humana es 10,5-11. [9]
La enzima funciona hidrolizando enlaces glicosídicos en peptidoglicanos . La enzima también puede romper los enlaces glicosídicos de la quitina , aunque no con tanta eficacia como las quitinasas verdaderas . [10]
El sitio activo de la lisozima se une a la molécula de peptidoglicano en la hendidura prominente entre sus dos dominios. Ataca a los peptidoglicanos (que se encuentran en las paredes celulares de las bacterias, especialmente las Gram positivas ), su sustrato natural , entre el ácido N -acetilmurámico (NAM) y el cuarto átomo de carbono de la N-acetilglucosamina (NAG).
Los sacáridos más cortos , como los tetrasacáridos, también han demostrado ser sustratos viables, pero a través de un intermediario con una cadena más larga. [11] También se ha demostrado que la quitina es un sustrato viable de lisozima. También se han desarrollado y utilizado sustratos artificiales en lisozima. [12]
El mecanismo de Phillips propuso que el poder catalítico de la enzima procedía tanto de la tensión estérica sobre el sustrato unido como de la estabilización electrostática de un intermedio de oxocarbenio . A partir de datos cristalográficos de rayos X, Phillips propuso el sitio activo de la enzima, donde se une un hexasacárido. La lisozima distorsiona el cuarto azúcar (en el subsitio D o -1) del hexasacárido en una conformación de media silla. En este estado de estrés, el enlace glicosídico se rompe más fácilmente. [13] Se crea un intermedio iónico que contiene un oxocarbenio como resultado de la ruptura del enlace glicosídico. [14] Por lo tanto, la distorsión que hace que la molécula del sustrato adopte una conformación tensa similar a la del estado de transición reducirá la barrera energética de la reacción. [15]
Arieh Warshel en 1978 especuló que el intermedio de oxocarbonio propuesto estaba estabilizado electrostáticamente mediante residuos de aspartato y glutamato en el sitio activo. El argumento de la estabilización electrostática se basó en la comparación con el agua a granel, la reorientación de los dipolos de agua puede anular la energía estabilizadora. de interacción de carga. En el modelo de Warshel, la enzima actúa como un superdisolvente, que fija la orientación de los pares iónicos y proporciona supersolvatación ( muy buena estabilización de los pares iónicos) y, especialmente, reduce la energía cuando dos iones están cerca uno del otro. [dieciséis]
El paso determinante de la velocidad (RDS) en este mecanismo está relacionado con la formación del intermedio oxocarbenio . Hubo algunos resultados contradictorios para indicar el RDS exacto. Al rastrear la formación del producto ( p-nitrofenol ), se descubrió que el RDS puede cambiar con diferentes temperaturas, lo que fue la razón de esos resultados contradictorios. A una temperatura más alta, el RDS es la formación de un intermedio de enzima glicosil y a una temperatura más baja, la descomposición de ese intermedio. [17]
En un debate inicial en 1969, Dahlquist propuso un mecanismo covalente para la lisozima basado en el efecto isotópico cinético , [14] pero durante mucho tiempo el mecanismo iónico fue más aceptado. En 2001, Vocadlo propuso un mecanismo revisado a través de un intermediario covalente pero no iónico. La evidencia del análisis ESI - MS indicó un intermedio covalente. Se usó un sustrato sustituido con 2-fluoro para reducir la velocidad de reacción y acumular un intermedio para la caracterización. [19] Se ha descubierto que las cadenas laterales de los aminoácidos ácido glutámico 35 (Glu35) y aspartato 52 (Asp52) son fundamentales para la actividad de esta enzima. Glu35 actúa como donante de protones al enlace glicosídico, escindiendo el enlace CO en el sustrato, mientras que Asp52 actúa como nucleófilo para generar una enzima glicosil intermedia. El Glu35 reacciona con el agua para formar ion hidroxilo, un nucleófilo más fuerte que el agua, que luego ataca al intermedio de la enzima glicosil, para dar el producto de la hidrólisis y dejar la enzima sin cambios. [20] Este tipo de mecanismo covalente para la catálisis enzimática fue propuesto por primera vez por Koshland . [21]
Más recientemente, las simulaciones de dinámica molecular de mecánica cuántica/mecánica molecular (QM/MM) han estado utilizando el cristal de HEWL y predicen la existencia de un intermedio covalente. [22] La evidencia de las estructuras ESI-MS y de rayos X indica la existencia de un intermedio covalente, pero se basa principalmente en el uso de un sustrato mutante o no nativo menos activo. Por lo tanto, la dinámica molecular QM/MM proporciona la capacidad única de investigar directamente el mecanismo de HEWL de tipo salvaje y el sustrato nativo. Los cálculos revelaron que el intermedio covalente del mecanismo covalente es ~30 kcal/mol más estable que el intermedio iónico del mecanismo de Phillips. [22] Estos cálculos demuestran que el intermedio iónico es extremadamente desfavorable desde el punto de vista energético y los intermedios covalentes observados en experimentos que utilizan sustratos mutantes o no nativos menos activos proporcionan información útil sobre el mecanismo de HEWL de tipo salvaje.
Los derivados de imidazol pueden formar un complejo de transferencia de carga con algunos residuos (dentro o fuera del centro activo) para lograr una inhibición competitiva de la lisozima. [23] En las bacterias Gram-negativas , el lipopolisacárido actúa como un inhibidor no competitivo mediante una unión altamente favorecida con la lisozima. [24]
A pesar de que se suponía que la actividad muramidasa de la lisozima desempeñaba un papel clave en sus propiedades antibacterianas, también se informó de su acción no enzimática. Por ejemplo, bloquear la actividad catalítica de la lisozima mediante la mutación de un aminoácido crítico en el sitio activo (52- Asp -> 52- Ser ) no elimina su actividad antimicrobiana. [25] La capacidad similar a la lectina de la lisozima para reconocer el antígeno de carbohidrato bacteriano sin actividad lítica se informó para el tetrasacárido relacionado con el lipopolisacárido de Klebsiella pneumoniae . [26] Además, la lisozima interactúa con anticuerpos y receptores de células T. [27]
La lisozima exhibe dos conformaciones: un estado activo abierto y un estado inactivo cerrado. La relevancia catalítica se examinó con transistores de efecto de campo (FET) de nanotubos de carbono de pared simple (SWCN), donde una lisozima singular estaba unida al FET SWCN. [28] El monitoreo electrónico de la lisozima mostró dos conformaciones, un sitio activo abierto y un sitio inactivo cerrado. En su estado activo, la lisozima es capaz de hidrolizar procesivamente su sustrato, rompiendo en promedio 100 enlaces a una velocidad de 15 por segundo. Para unirse a un nuevo sustrato y pasar del estado inactivo cerrado al estado activo abierto se requieren dos cambios de pasos de conformación, mientras que la inactivación requiere un paso.
La lisozima de tipo C convencional es parte de un grupo más grande de enzimas relacionadas estructural y mecánicamente denominada superfamilia de lisozimas . Esta familia une las lisozimas de tipo C ("pollo") GH22 con la quitinasa vegetal GH19 , la lisozima de tipo G ("ganso") GH23, la lisozima de tipo V ("viral") GH24 y las familias de quitosanasas GH46 . La nomenclatura del tipo de lisozima solo refleja la fuente de la que se aisló originalmente un tipo y no refleja completamente la distribución taxonómica. [29] Por ejemplo, los humanos y muchos otros mamíferos tienen dos genes de lisozima de tipo G, LYG1 y LYG2. [30]
La lisozima es parte del sistema inmunológico innato. Los niveles reducidos de lisozima se han asociado con displasia broncopulmonar en recién nacidos. [35] Los lechones alimentados con leche de lisozima humana pueden recuperarse más rápidamente de la enfermedad diarreica causada por E. coli . La concentración de lisozima en la leche humana es de 1.600 a 3.000 veces mayor que la concentración en la leche de ganado. La lisozima humana es más activa que la lisozima de clara de huevo de gallina. Se desarrolló una línea transgénica de cabras (con un fundador llamado "Artemis") para producir leche con lisozima humana para proteger a los niños de la diarrea si no pueden obtener los beneficios de la lactancia materna humana. [36] [37]
Dado que la lisozima es una forma natural de protección contra patógenos grampositivos como Bacillus y Streptococcus , [38] desempeña un papel importante en la inmunología de los lactantes alimentados con leche materna. [39] Mientras que la piel es una barrera protectora debido a su sequedad y acidez, la conjuntiva (membrana que cubre el ojo) está, en cambio, protegida por enzimas secretadas, principalmente lisozima y defensina . Sin embargo, cuando estas barreras protectoras fallan, se produce conjuntivitis .
En ciertos cánceres (especialmente la leucemia mielomonocítica), la producción excesiva de lisozima por parte de las células cancerosas puede provocar niveles tóxicos de lisozima en la sangre. Los niveles elevados de lisozima en sangre pueden provocar insuficiencia renal y niveles bajos de potasio en sangre, afecciones que pueden mejorar o resolverse con el tratamiento de la neoplasia maligna primaria.
La lisozima sérica es mucho menos específica para el diagnóstico de sarcoidosis que la enzima convertidora de angiotensina sérica; sin embargo, al ser más sensible, se utiliza como marcador de la actividad de la enfermedad sarcoidosis y es adecuado para el seguimiento de la enfermedad en casos comprobados. [40]
La primera síntesis química de una proteína lisozima fue intentada por el profesor George W. Kenner y su grupo de la Universidad de Liverpool en Inglaterra. [41] Esto finalmente lo logró en 2007 Thomas Durek en el laboratorio de Steve Kent en la Universidad de Chicago, quien creó una molécula sintética de lisozima funcional. [42]
Los cristales de lisozima se han utilizado para cultivar otros materiales funcionales para catálisis y aplicaciones biomédicas. [43] [44] [45] La lisozima es una enzima comúnmente utilizada para lisar bacterias grampositivas. [46] Debido a la función única de la lisozima en la que puede digerir la pared celular y causar shock osmótico (explotar la célula al cambiar repentinamente la concentración de soluto alrededor de la célula y, por lo tanto, la presión osmótica ), la lisozima se usa comúnmente en el laboratorio para liberar proteínas del periplasma de la bacteria mientras que la membrana interna permanece sellada como vesículas llamadas esferoplasto . [47] [48]
Por ejemplo, E. coli se puede lisar usando lisozima para liberar el contenido del espacio periplásmico . Es especialmente útil en el laboratorio para intentar recolectar el contenido del periplasma. [1] El tratamiento con lisozima es óptimo a temperaturas, rangos de pH y concentraciones de sal particulares. La actividad de la lisozima aumenta con el aumento de la temperatura, hasta 60 grados Celsius, con un rango de pH de 6,0 a 7,0. Las sales presentes también afectan el tratamiento con lisozima, donde algunas afirman tener efectos inhibidores y otras promueven la lisis mediante el tratamiento con lisozima. El cloruro de sodio induce la lisis, pero en altas concentraciones es un inhibidor activo de la lisis. Se han observado observaciones similares con el uso de sales de potasio. Existen ligeras variaciones debido a diferencias en las cepas bacterianas. [49] Una consecuencia del uso de lisozima en la extracción de proteínas recombinantes para la cristalización de proteínas es que el cristal puede estar contaminado con unidades de lisozima, produciendo una combinación fisiológicamente irrelevante. De hecho, algunas proteínas simplemente no pueden cristalizar sin dicha contaminación. [50] [51]
Además, la lisozima puede servir como herramienta en la expresión de proteínas recombinantes tóxicas. La expresión de proteínas recombinantes en cepas BL21 (DE3) normalmente se logra mediante la ARN polimerasa T7. Mediante la inducción de IPTG, se inhibe el represor UV-5, lo que conduce a la transcripción de la ARN polimerasa T7 y, por tanto, de la proteína de interés. Sin embargo, se puede observar un nivel basal de la ARN polimerasa T7 incluso sin inducción. La lisozima T7 actúa como inhibidor de la ARN polimerasa T7. Las cepas recientemente inventadas, que contienen un plásmido auxiliar (pLysS), coexpresan constitutivamente niveles bajos de lisozima T7, lo que proporciona una alta rigurosidad y una expresión consistente de la proteína recombinante tóxica. [52]
La propiedad antibacteriana de la clara de huevo de gallina, debido a la lisozima que contiene, fue observada por primera vez por Laschtschenko en 1909. [53] La actividad del moco nasal para matar bacterias fue demostrada en 1922 por Alexander Fleming , el descubridor de la penicilina , quien acuñó el término término "lisozima". [54] Se dice que dijo: "Como esta sustancia tiene propiedades similares a las de los fermentos, la he llamado 'lisozima'". [55] Fleming continuó demostrando que una sustancia enzimática estaba presente en una amplia variedad de secreciones y era capaz de lisar rápidamente (es decir, disolver) diferentes bacterias, particularmente un "coco" amarillo que estudió". [56 ]
La lisozima fue cristalizada por primera vez por Edward Abraham en 1937, lo que permitió que David Chilton Phillips describiera la estructura tridimensional de la lisozima de clara de huevo de gallina en 1965, cuando obtuvo el primer modelo de resolución de 2 ångström (200 pm ) mediante cristalografía de rayos X. . [57] [58] La estructura se presentó públicamente en una conferencia de la Royal Institution en 1965. [59] La lisozima fue la segunda estructura proteica y la primera estructura enzimática que se resolvió mediante métodos de difracción de rayos X, y la primera enzima que se resolvió completamente. secuenciado que contiene los veinte aminoácidos comunes. [60] Como resultado de la elucidación de la estructura de la lisozima por parte de Phillips, también fue la primera enzima en tener un mecanismo detallado y específico sugerido para su método de acción catalítica. [61] [62] [63] Este trabajo llevó a Phillips a proporcionar una explicación de cómo las enzimas aceleran una reacción química en términos de sus estructuras físicas. El mecanismo original propuesto por Phillips fue revisado más recientemente. [19]
