Un conducto de guía nerviosa (también conocido como conducto nervioso artificial o injerto nervioso artificial , en contraposición a un autoinjerto ) es un medio artificial para guiar el recrecimiento axonal para facilitar la regeneración nerviosa y es uno de los varios tratamientos clínicos para las lesiones nerviosas . Cuando la sutura directa de los dos muñones de un nervio cortado no se puede lograr sin tensión, el tratamiento clínico estándar para las lesiones de los nervios periféricos es el injerto nervioso autólogo . Debido a la disponibilidad limitada de tejido donante y la recuperación funcional en el injerto nervioso autólogo, la investigación de ingeniería de tejidos neuronales se ha centrado en el desarrollo de conductos de guía nerviosa bioartificiales como un tratamiento alternativo, especialmente para defectos grandes. También se están explorando técnicas similares para la reparación nerviosa en la médula espinal, pero la regeneración nerviosa en el sistema nervioso central plantea un mayor desafío porque sus axones no se regeneran apreciablemente en su entorno nativo. [1]
La creación de conductos artificiales también se conoce como entubulación porque los extremos nerviosos y el espacio intermedio están encerrados dentro de un tubo compuesto de materiales biológicos o sintéticos. [2] Ya sea que el conducto tenga la forma de un tubo biológico, un tubo sintético o un conducto diseñado mediante ingeniería tisular, debe facilitar la comunicación neurotrófica y neurotrófica entre los extremos proximal y distal del espacio nervioso, bloquear los factores inhibidores externos y proporcionar una guía física para el recrecimiento axonal. [3] El objetivo más básico de un conducto de guía nerviosa es combinar señales físicas, químicas y biológicas en condiciones que fomenten la formación de tejido. [4]
Los materiales que se han utilizado para fabricar tubos biológicos incluyen vasos sanguíneos y músculos esqueléticos, mientras que los tubos sintéticos no absorbibles y bioabsorbibles se han fabricado a partir de silicona y poliglicólido respectivamente. [5] Los conductos de guía nerviosa diseñados por ingeniería tisular son una combinación de muchos elementos: estructura de andamiaje, material de andamiaje, terapias celulares, factores neurotróficos y materiales biomiméticos . La elección de qué señales físicas, químicas y biológicas utilizar se basa en las propiedades del entorno nervioso, que es fundamental para crear el entorno más deseable para la regeneración axonal. Los factores que controlan la selección del material incluyen biocompatibilidad , biodegradabilidad , [6] integridad mecánica, [3] controlabilidad durante el crecimiento nervioso, la implantación y la esterilización.
En ingeniería de tejidos , se consideran tres niveles principales de estructura de andamiaje:
La superestructura de un conducto o andamio es importante para simular las condiciones in vivo de formación de tejido nervioso. La matriz extracelular, que es la principal responsable de dirigir el crecimiento y la formación de tejido, tiene una superestructura compleja creada por muchas moléculas fibrosas entrelazadas. Las formas de formar una superestructura artificial incluyen el uso de hidrogeles termorresponsivos, canales orientados longitudinalmente, fibras orientadas longitudinalmente, axones desarrollados por estiramiento y andamios nanofibrosos.
En una lesión cerebral traumática (LCT), se inicia una serie de eventos dañinos que conducen a la muerte celular y disfunción general, lo que causa la formación de una cavidad de lesión de forma irregular. [8] La cavidad resultante causa muchos problemas para los andamios diseñados mediante ingeniería de tejidos porque se requiere una implantación invasiva y, a menudo, el andamio no se adapta a la forma de la cavidad. Para superar estas dificultades, se han diseñado hidrogeles termorresponsivos para que experimenten transiciones de solución-gelificación (sol-gel), que son causadas por diferencias en las temperaturas ambiente y fisiológicas, para facilitar la implantación a través de la gelificación in situ y la conformación a la forma de la cavidad causada, lo que permite que se inyecten de manera mínimamente invasiva. [8]
La metilcelulosa (MC) es un material con transiciones sol-gel bien definidas en el rango óptimo de temperaturas. La gelificación de MC ocurre debido a un aumento en las interacciones hidrofóbicas intra e intermoleculares a medida que aumenta la temperatura. [8] La transición sol-gel está regida por la temperatura crítica inferior de la solución (LCST), que es la temperatura a la que el módulo elástico es igual al módulo viscoso. La LCST no debe superar la temperatura fisiológica (37 °C) para que el andamio se gelifique tras la implantación, creando una administración mínimamente invasiva. Tras la implantación en una cavidad con lesión cerebral traumática o en un conducto guía de nervio periférico, la MC provoca una respuesta inflamatoria mínima. [8] También es muy importante para la administración mínimamente invasiva que la solución de MC tenga una viscosidad a temperaturas inferiores a su LCST, lo que permite inyectarla a través de una aguja de pequeño calibre para su implantación en aplicaciones in vivo . [8] La MC se ha utilizado con éxito como agente de administración para terapias farmacéuticas intraópticas y orales. [8] Algunas desventajas del MC incluyen su limitada propensión a la adsorción de proteínas y la adhesión celular neuronal, lo que lo convierte en un hidrogel no bioactivo. Debido a estas desventajas, el uso de MC en la regeneración de tejido neuronal requiere la unión de un grupo biológicamente activo a la estructura principal del polímero para mejorar la adhesión celular.
Otro gel termorresponsivo es el que se forma combinando quitosano con sal de glicerofosfato (GP). [9] Esta solución experimenta gelificación a temperaturas superiores a 37 °C. La gelificación del quitosano/GP es bastante lenta, tardando media hora en fraguar inicialmente y 9 horas más en estabilizarse por completo. La fuerza del gel varía de 67 a 1572 Pa dependiendo de la concentración de quitosano; el extremo inferior de este rango se acerca a la rigidez del tejido cerebral. El quitosano/GP ha demostrado ser exitoso in vitro , pero se necesita la adición de polilisina para mejorar la adhesión de las células nerviosas. La polilisina se unió covalentemente al quitosano para evitar que se difundiera. La polilisina se seleccionó debido a su naturaleza positiva y alta hidrofilicidad, que promueve el crecimiento de las neuritas . La supervivencia de las neuronas se duplicó, aunque el crecimiento de las neuritas no cambió con la polilisina añadida. [9]
Los canales orientados longitudinalmente son estructuras macroscópicas que se pueden agregar a un conducto para dar a los axones en regeneración una guía bien definida para crecer en línea recta a lo largo del andamio. En un andamio con arquitectura de canal microtubular , los axones en regeneración pueden extenderse a través de canales longitudinales abiertos como lo harían normalmente a través de los tubos endoneuriales de los nervios periféricos. [10] Además, los canales aumentan el área de superficie disponible para el contacto celular. Los canales generalmente se crean insertando una aguja, un alambre o una segunda solución de polímero dentro de un andamio de polímero; después de estabilizar la forma del polímero principal, se retira la aguja, el alambre o el segundo polímero para formar los canales. Por lo general, se crean múltiples canales; sin embargo, el andamio puede constar de un solo canal grande, que es simplemente un tubo hueco.
Wang et al. crearon una técnica de moldeo para formar un conducto de guía nerviosa con una matriz interna de múltiples canales y una pared de tubo exterior de quitosano. [10] En su estudio de 2006, Wang et al. enhebraron agujas de acupuntura a través de un tubo hueco de quitosano, donde se mantuvieron en su lugar fijando, en cada extremo, parches creados mediante CAD. Luego se inyecta una solución de quitosano en el tubo y se solidifica, después de lo cual se retiran las agujas, creando canales orientados longitudinalmente. Luego se creó un andamio representativo para la caracterización con 21 canales utilizando agujas de acupuntura de 400 μm de diámetro. Al examinarlos con un microscopio, se descubrió que los canales eran aproximadamente circulares con ligeras irregularidades; todos los canales estaban alineados con el diámetro interno de la pared del tubo exterior. Se confirmó mediante imágenes de micro-CT que los canales atravesaban toda la longitud del andamio. Bajo la absorción de agua, los diámetros interno y externo del andamio se hicieron más grandes, pero los diámetros de los canales no variaron significativamente, lo cual es necesario para mantener la forma del andamio que guía la extensión de las neuritas. La estructura interna proporciona un aumento en la resistencia a la compresión en comparación con un tubo hueco solo, lo que puede evitar el colapso del andamio sobre las neuritas en crecimiento. Las células Neuro-2a pudieron crecer en la matriz interna del andamio y se orientaron a lo largo de los canales. Aunque este método solo se ha probado en quitosano, se puede adaptar a otros materiales. [10]
El proceso de liofilización y calentamiento de alambres es otro método para crear canales orientados longitudinalmente, desarrollado por Huang et al. (2005). [11] Se congeló una solución de quitosano y ácido acético alrededor de alambres de níquel-cobre (Ni-Cu) en una trampa de nitrógeno líquido ; posteriormente, los alambres se calentaron y se retiraron. Se eligieron alambres de Ni-Cu porque tienen un alto nivel de resistencia. Se utilizaron liofilizadores controlados por temperatura para sublimar el ácido acético. No hubo evidencia de que los canales se fusionaran o dividieran. Después de la liofilización, las dimensiones del andamio se encogieron, lo que provocó que los canales fueran un poco más pequeños que el alambre utilizado. Los andamios se neutralizaron a un valor de pH fisiológico utilizando una base, lo que tuvo efectos dramáticos en la estructura porosa. [11] Las bases más débiles mantuvieron la estructura porosa uniforme, pero la base más fuerte la hizo incontrolable. La técnica utilizada aquí se puede modificar ligeramente para adaptarse a otros polímeros y solventes. [11]
Otra forma de crear canales orientados longitudinalmente es crear un conducto a partir de un polímero con fibras orientadas longitudinalmente incrustadas de otro polímero; luego disolver selectivamente las fibras para formar canales orientados longitudinalmente. Las fibras de policaprolactona (PCL) se incrustaron en un andamio de (hidroxietil)metacrilato (HEMA). Se eligió PCL sobre poli (ácido láctico) (PLA) y poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), porque es insoluble en HEMA pero soluble en acetona . Esto es importante porque se utilizó HEMA para el material del conducto principal y se utilizó acetona para disolver selectivamente las fibras de polímero. Las fibras de PCL extruidas se insertaron en un tubo de vidrio y se inyectó la solución de HEMA. La cantidad de canales creados fue constante de un lote a otro y las variaciones en el diámetro de la fibra se pudieron reducir creando un sistema de extrusión de fibra de PCL más controlado. [12] Se confirmó que los canales formados eran continuos y homogéneos mediante el examen de las variaciones de porosidad. Este proceso es seguro, reproducible y tiene dimensiones controlables. [12] En un estudio similar realizado por Yu y Shoichet (2005), se copolimerizó HEMA con AEMA para crear un gel P(HEMA-co-AMEA). Se incrustaron fibras de policaprolactona (PCL) en el gel y luego se disolvieron selectivamente con acetona con sonicación para crear canales. Se descubrió que HEMA en mezcla con 1% de AEMA creó los geles más fuertes. [13] En comparación con los andamios sin canales, la adición de 82 a 132 canales puede proporcionar un aumento de aproximadamente 6 a 9 veces en el área de superficie, lo que puede ser ventajoso para estudios de regeneración que dependen de señales mediadas por contacto. [13]
Itoh et al. (2003) desarrollaron un andamio que consiste en un solo canal grande orientado longitudinalmente que se creó utilizando tendones de quitosano de cangrejos. [14] Los tendones se recolectaron de cangrejos (Macrocheira kaempferi) y se lavaron repetidamente con solución de hidróxido de sodio para eliminar las proteínas y desacetilar la quitina del tendón , que posteriormente se conoció como quitosano del tendón. Se insertó una barra de acero inoxidable con una sección transversal de forma triangular (cada lado de 2,1 mm de largo) en un tubo hueco de quitosano de tendón de sección transversal de forma circular (diámetro: 2 mm; longitud: 15 mm). Al comparar los tubos de forma circular y triangular, se encontró que los tubos triangulares habían mejorado la resistencia mecánica, mantenían mejor su forma y aumentaban el área de superficie disponible. [14] Si bien este es un método eficaz para crear un solo canal, no proporciona tanta área de superficie para el crecimiento celular como los andamios de múltiples canales.
Newman et al. (2006) insertaron fibras conductoras y no conductoras en un andamio de colágeno-TERP (colágeno reticulado con un terpolímero de poli(N-isopropilacrilamida) (PNiPAAm)). Las fibras se incrustaron envolviéndolas firmemente en un pequeño portaobjetos de vidrio y colocando una solución de colágeno-TERP entre este y otro portaobjetos de vidrio; los espaciadores entre los portaobjetos de vidrio fijaron el espesor del gel a 800 μm. Las fibras conductoras fueron fibra de carbono y Kevlar , y las fibras no conductoras fueron nailon-6 y alambre de tungsteno. Las neuritas se extienden en todas las direcciones en haces gruesos en la fibra de carbono; sin embargo, con las otras tres fibras, las neuritas se extendieron en conformaciones finas similares a una red. Las neuritas no mostraron crecimiento direccional en las fibras de carbono y Kevlar, pero crecieron a lo largo de las fibras de nailon-6 y en cierta medida a lo largo del alambre de tungsteno. Las estructuras de alambre de tungsteno y fibra de nailon-6 mostraron neuritas que crecieron en el gel cerca de la interfaz entre la fibra y el gel, además de crecer a lo largo de la superficie. Todos los geles de fibra, excepto el de Kevlar, mostraron un aumento significativo en la extensión de las neuritas en comparación con los geles sin fibra. No hubo diferencias en la extensión de las neuritas entre las fibras no conductoras y las conductoras. [15]
En su estudio de 2005, Cai et al. añadieron microfilamentos de ácido poliláctico (PLLA) a tubos huecos de ácido poliláctico (PLA) y silicona. Las características de guía de las microfibras estaban inversamente relacionadas con el diámetro de la fibra, y los diámetros más pequeños promovían una mejor migración celular orientada longitudinalmente y la regeneración axonal. Las microfibras también promovían la mielinización durante la reparación de los nervios periféricos. [16]
Se ha demostrado que los tractos axónicos maduros experimentan crecimiento cuando se estiran mecánicamente en la parte central del cilindro axónico. [17] Dicho estiramiento mecánico se aplicó mediante un biorreactor de crecimiento y estiramiento axónico personalizado compuesto por cuatro componentes principales: cámara de expansión axónica diseñada a medida, mesa de movimiento lineal, motor paso a paso y controlador. [17] El cultivo de tejido nervioso se coloca dentro de la cámara de expansión con un puerto para el intercambio de gases y un marco de estiramiento extraíble, que puede separar dos grupos de somas (cuerpos celulares neuronales) y, por lo tanto, estirar sus axones. [17] Se utilizó gel de colágeno para promover el crecimiento de tractos axónicos más grandes desarrollados por estiramiento que eran visibles a simple vista. Hay dos razones para la mejora del crecimiento debido al recubrimiento de colágeno: 1) el cultivo se volvió hidrófobo después de que el colágeno se secó, lo que permitió que creciera una concentración más densa de neuronas, y 2) el recubrimiento de colágeno creó un recubrimiento sin obstrucciones a lo largo de los dos sustratos de elongación. [17] El examen con microscopio electrónico de barrido y TEM no mostró signos de adelgazamiento de los axones debido al estiramiento, y el citoesqueleto parecía normal e intacto. Los tractos axónicos desarrollados por estiramiento se cultivaron en una membrana biocompatible, que se podía formar directamente en una estructura cilíndrica para el trasplante, eliminando la necesidad de transferir los axones a un andamio una vez completado el crecimiento. Los axones desarrollados por estiramiento pudieron crecer a una velocidad sin precedentes de 1 cm/día después de solo 8 días de aclimatación, que es mucho mayor que la velocidad de crecimiento máxima de 1 mm/día medida para la extensión del cono de crecimiento. La velocidad de 1 mm/día es también la velocidad de transporte promedio para elementos estructurales como los neurofilamentos. [17]
La investigación sobre fibras a escala nanométrica intenta imitar el entorno extracelular in vivo para promover el crecimiento direccional y la regeneración. [7] Tres métodos distintos para formar andamios nanofibrosos son el autoensamblaje, la separación de fases y el electrohilado. Sin embargo, existen muchos otros métodos para formar andamios nanofibrosos.
El autoensamblaje de andamios nanofibrosos solo puede ocurrir cuando las propias fibras están diseñadas para el autoensamblaje. Una forma común de impulsar el autoensamblaje de las fibras del andamiaje es usar péptidos anfifílicos de modo que en el agua la fracción hidrofóbica impulse el autoensamblaje. [7] La ingeniería cuidadosamente calculada de los péptidos anfifílicos permite un control preciso sobre la matriz autoensamblada. El autoensamblaje puede crear topografías tanto ordenadas como desordenadas. Phillips et al. (2005) desarrollaron y probaron in vitro e in vivo una matriz de células de Schwann de colágeno autoalineada , que permitió la alineación de la extensión de neuritas DRG in vitro . Los geles de colágeno se han utilizado ampliamente como sustratos para el cultivo de tejidos tridimensionales . Las células pueden formar uniones mediadas por integrinas con el colágeno, lo que inicia el ensamblaje del citoesqueleto y la motilidad celular. A medida que las células se mueven a lo largo de las fibras de colágeno, generan fuerzas que contraen el gel. Cuando las fibras de colágeno están unidas en ambos extremos, las fuerzas generadas por las células crean una tensión uniaxial, lo que hace que las células y las fibras de colágeno se alineen. Las ventajas de esta matriz son su simplicidad y velocidad de preparación. [2] La fibronectina plasmática soluble también puede autoensamblarse en fibras insolubles estables cuando se somete a un cizallamiento mecánico directo dentro de una solución viscosa. Phillips et al. (2004) investigaron un nuevo método de agregación por cizallamiento que provoca una agregación mejorada. [18] El cizallamiento mecánico se creó arrastrando un bolo de 0,2 ml a 3 cm con fórceps; la fibronectina se agrega en fibras insolubles en la interfaz de rápido movimiento en una celda de ultrafiltración. El mecanismo propuesto para esta agregación de fibras es la extensión y elongación de proteínas bajo una fuerza de cizallamiento mecánico, lo que conduce al empaquetamiento lateral y la agregación de proteínas de las fibras. Phillips et al. demostraron que el cizallamiento mecánico producido al estirar un gel de fibronectina de alta viscosidad provoca cambios sustanciales en su estructura y que cuando se aplica a través de una extensión uniaxial, un gel de fibronectina viscoso forma agregados fibrosos de fibronectina orientados; además, los agregados fibrosos tienen una solubilidad disminuida y pueden soportar varios tipos de células in vitro. [18]
La separación de fases permite crear estructuras de fibras submicrométricas tridimensionales sin el uso de equipo especializado. Los cinco pasos involucrados en la separación de fases son la disolución del polímero, la separación de fases y la gelificación, la extracción del solvente del gel, la congelación y la liofilización en agua. [7] El producto final es una red de fibras continua. La separación de fases se puede modificar para adaptarse a muchas aplicaciones diferentes, y la estructura de los poros se puede variar utilizando diferentes solventes, lo que puede cambiar todo el proceso de líquido-líquido a sólido-líquido. La porosidad y el diámetro de la fibra también se pueden modificar variando la concentración inicial del polímero; una concentración inicial más alta conduce a menos poros y diámetros de fibra más grandes. Esta técnica se puede utilizar para crear redes de fibras con diámetros que alcanzan los diámetros de las fibras de colágeno tipo I. La red fibrosa creada está orientada aleatoriamente y hasta ahora no se ha trabajado para intentar organizar las fibras. La separación de fases es una técnica ampliamente utilizada para crear estructuras nanofibrosas altamente porosas con facilidad. [7]
El electrohilado proporciona una plataforma robusta para el desarrollo de conductos sintéticos de guía nerviosa. El electrohilado puede servir para crear andamios en dimensiones controladas con química y topografía variables. Además, se pueden encapsular diferentes materiales dentro de las fibras, incluidas partículas, factores de crecimiento e incluso células. [19] El electrohilado crea fibras cargando eléctricamente una gota de polímero fundido o solución y suspendiéndola de un capilar. Luego, se aplica un campo eléctrico en un extremo del capilar hasta que la carga excede la tensión superficial, creando un chorro de polímero que se alarga y adelgaza. Este chorro de polímero se descarga como un cono de Taylor, dejando atrás polímeros cargados eléctricamente, que se recogen en una superficie conectada a tierra como disolvente a medida que el disolvente se evapora de los chorros. [20] Se han hilado fibras con diámetros que van desde menos de 3 nm a más de 1 μm. El proceso se ve afectado por parámetros del sistema como el tipo de polímero, el peso molecular del polímero y las propiedades de la solución, y por parámetros del proceso como la velocidad de flujo, el voltaje, el diámetro del capilar, la distancia entre el colector y el capilar y el movimiento del colector. [21] La red fibrosa creada no está ordenada y contiene una alta relación superficie-volumen como resultado de una alta porosidad; una gran superficie de red es ideal para el crecimiento y transporte de desechos y nutrientes en la ingeniería de tejidos neuronales. [7] Las dos características de los andamios electrohilados que son ventajosas para la ingeniería de tejidos neuronales son la morfología y la arquitectura, que imitan de cerca la ECM, y los poros, que son del rango correcto de tamaños que permite el intercambio de nutrientes pero previene el crecimiento de tejido cicatricial glial (alrededor de 10 μm). [22] Se ha demostrado que los andamios de PLLA electrohilados aleatorios tienen una mayor adhesión celular, lo que puede deberse a una mayor rugosidad de la superficie. [22] También se ha demostrado que las esteras de fibra electrohilada modificadas químicamente influyen en la diferenciación de células madre neuronales y aumentan la proliferación celular. [20] En la última década, los científicos también han desarrollado numerosos métodos para la producción de andamios de nanofibras alineadas, que sirven para proporcionar señales topográficas adicionales a las células. [23] Esto es ventajoso porque los andamios alineados tridimensionales a gran escala no se pueden crear fácilmente utilizando técnicas de fabricación tradicionales. [7]En un estudio realizado por Yang et al. (2005), se crearon, caracterizaron y compararon andamios de nanofibras y microfibras de poli(ácido L-láctico) (PLLA) electrohilados alineados y aleatorios. Los diámetros de las fibras fueron directamente proporcionales a la concentración inicial de polímero utilizada para el electrohilado; el diámetro promedio de las fibras alineadas fue menor que el de las fibras aleatorias en condiciones de procesamiento idénticas. Se demostró que las células madre neuronales se alargaron en paralelo a las fibras electrohiladas alineadas. [21] Las nanofibras alineadas tenían una longitud de neurita promedio más larga en comparación con las microfibras alineadas, las microfibras aleatorias y las nanofibras aleatorias. Además, se diferenciaron más células en las nanofibras alineadas que en las microfibras alineadas. [21] Por lo tanto, los resultados de este estudio demostraron que las nanofibras alineadas pueden ser más beneficiosas que las fibras o microfibras no alineadas para promover la regeneración nerviosa.
La microestructura y la nanoestructura, junto con la superestructura, son los tres niveles principales de la estructura del andamio que merecen consideración al crear la topografía del andamio. [7] Mientras que la superestructura se refiere a la forma general del andamio, la microestructura se refiere a la estructura a nivel celular de la superficie y la nanoestructura se refiere a la estructura a nivel subcelular de la superficie. Los tres niveles de estructura son capaces de provocar respuestas celulares; sin embargo, existe un interés significativo en la respuesta de las células a la topografía a nanoescala motivada por la presencia de numerosas estructuras a nanoescala dentro de la matriz extracelular. [7] Hay un número creciente de métodos para la fabricación de micro y nanoestructuras (muchas originadas en la industria de semiconductores) que permiten la creación de varias topografías con tamaño, forma y química controlados. [24]
Las señales físicas se forman creando una estructura de superficie ordenada a nivel de la microestructura y/o nanoestructura. Se ha demostrado que las señales físicas a escala nanométrica modulan la adhesión celular, la migración, la orientación, la inhibición del contacto, la expresión génica y la formación del citoesqueleto. Esto permite la dirección de procesos celulares como la proliferación, la diferenciación y la propagación. [24] Existen numerosos métodos para la fabricación de topografías a escala micro y nanométrica, que pueden dividirse en aquellos que crean topografías ordenadas y aquellos que crean topografías desordenadas.
Las topografías ordenadas se definen como patrones organizados y geométricamente precisos. [7] Aunque existen muchos métodos para crear topografías ordenadas, suelen requerir mucho tiempo, habilidad y experiencia y el uso de equipos costosos. [7]
La fotolitografía implica exponer una fuente de luz a una oblea de silicio recubierta de fotorresistencia; se coloca una máscara con el patrón deseado entre la fuente de luz y la oblea, lo que permite de forma selectiva que la luz se filtre y cree el patrón en la fotorresistencia . Un mayor desarrollo de la oblea hace que aparezca el patrón en la fotorresistencia. La fotolitografía realizada en el ultravioleta cercano a menudo se considera el estándar para fabricar topografías en la microescala. [7] Sin embargo, debido a que el límite inferior para el tamaño es una función de la longitud de onda, este método no se puede utilizar para crear características a nanoescala. [7] En su estudio de 2005, Mahoney et al. crearon matrices organizadas de canales de poliimida (11 μm de altura y 20-60 μm de ancho) que se crearon en un sustrato de vidrio mediante fotolitografía. [25] Se utilizó poliimida porque se adhiere bien al vidrio, es químicamente estable en solución acuosa y es biocompatible. Se ha planteado la hipótesis de que los microcanales limitaban el rango de ángulos en los que los elementos del citoesqueleto dentro de los conos de crecimiento de las neuritas podían acumularse, ensamblarse y orientarse. [25] Hubo una disminución significativa en el número de neuritas que emergían del soma; sin embargo, hubo una disminución menor a medida que aumentaba el rango de ángulos en los que emergían las neuritas. Además, las neuritas eran en promedio dos veces más largas cuando las neuronas se cultivaban en los microcanales en comparación con los controles en una superficie plana; esto podría deberse a una alineación más eficiente de los filamentos. [25]
En la litografía por haz de electrones (EBL), una resina sensible a los electrones se expone a un haz de electrones de alta energía. Existe la opción de una resina de tipo positivo o negativo; sin embargo, se puede obtener una resolución de características más baja con las resinas negativas. [26] Los patrones se crean programando el haz de electrones para que siga la ruta exacta a lo largo de la superficie del material. La resolución se ve afectada por otros factores, como la dispersión de electrones en la resina y la retrodispersión del sustrato. La EBL puede crear características de superficie única del orden de 3 a 5 nm. Si se requieren múltiples características en una gran superficie, como es el caso de la ingeniería de tejidos, la resolución disminuye y solo se pueden crear características tan pequeñas como 30 a 40 nm, y el desarrollo de la resina comienza a pesar más en la formación del patrón. [26] Para evitar la disolución de la resina, se puede utilizar agitación ultrasónica para superar las fuerzas intermoleculares. Además, el alcohol isopropílico (IPA) ayuda a desarrollar matrices de alta densidad. La EBL puede convertirse en un proceso más rápido y menos costoso al replicar patrones nanométricos en materiales poliméricos; el proceso de replicación se ha demostrado con policaprolactona (PCL) utilizando estampado en caliente y fundición con solvente . [7] En un estudio realizado por Gómez et al. (2007), se demostró que los microcanales de 1 y 2 μm de ancho y 400 y 800 nm de profundidad creados por EBL en PDMS mejoran la formación de axones de células hipocampales en cultivo más que las señales químicas inmovilizadas. [26]
La litografía de rayos X es otro método para formar patrones ordenados que se pueden utilizar para investigar el papel que desempeña la topografía en la promoción de la neuritogénesis. Los parámetros de la máscara determinan la periodicidad del patrón, pero el ancho y la profundidad de las crestas están determinados por las condiciones de grabado. En un estudio, se crearon crestas con períodos que iban de 400 a 4000 nm, anchos que iban de 70 a 1900 nm y una profundidad de surco de 600 nm; las neuritas en desarrollo demostraron una guía de contacto con características tan pequeñas como 70 nm y más del 90% de las neuritas estaban dentro de los 10 grados de alineación paralela con las crestas y los surcos. [27] No hubo una diferencia significativa en la orientación con respecto a los tamaños de las características utilizadas. El número de neuritas por célula estaba limitado por las crestas y los surcos, lo que produjo fenotipos bipolares en lugar de ramificados. [27]
Las topografías desordenadas se crean generalmente mediante procesos que ocurren espontáneamente durante otros procesos; los patrones tienen una orientación y organización aleatorias con un control impreciso o nulo sobre la geometría de las características. [7] La ventaja de crear topografías desordenadas en comparación con las ordenadas es que los procesos suelen requerir menos tiempo, son menos costosos y no requieren gran habilidad y experiencia. Las topografías desordenadas se pueden crear mediante desmezcla de polímeros, litografía coloidal y grabado químico.
En la desmezcla de polímeros , las mezclas de polímeros experimentan una separación de fases espontánea; a menudo ocurre durante condiciones como la fundición por centrifugado sobre obleas de silicio. Las características que se pueden crear mediante este método incluyen fosas, islas y cintas a escala nanométrica, que se pueden controlar hasta cierto punto ajustando la proporción y la concentración del polímero para cambiar la forma y el tamaño de la característica, respectivamente. [7] No hay mucho control en la dirección horizontal, aunque la dirección vertical de las características se puede controlar con precisión. Debido a que el patrón es muy desordenado horizontalmente, este método solo se puede utilizar para estudiar las interacciones celulares con nanotopografías de altura específica . [7]
La litografía coloidal es económica y se puede utilizar para crear superficies con alturas y diámetros controlados. Los nanocoloides se utilizan como máscara de grabado extendiéndolos a lo largo de la superficie del material y luego se utiliza el bombardeo con haz de iones o la evaporación de película para grabar alrededor de los nanocoloides, creando nanocolumnas y nanofosas, respectivamente. La estructura de la superficie final se puede controlar variando el área cubierta por coloides y el tamaño del coloide. El área cubierta por los coloides se puede cambiar modificando la fuerza iónica de la solución coloidal. Esta técnica es capaz de crear grandes áreas de superficie estampadas, lo que es necesario para aplicaciones de ingeniería de tejidos. [7]
El grabado químico implica remojar la superficie del material en un agente de grabado como ácido fluorhídrico (HF) o hidróxido de sodio (NaOH) hasta que la superficie se grabe hasta obtener la rugosidad deseada, creada por picaduras y protuberancias en la escala nanométrica. [7] Los tiempos de grabado más largos dan lugar a superficies más rugosas (es decir, picaduras y protuberancias superficiales más pequeñas). No se pueden crear estructuras con una geometría u organización específicas mediante este método rudimentario porque, en el mejor de los casos, se puede considerar un tratamiento de superficie para cambiar la rugosidad de la superficie. Las ventajas significativas de este método son la facilidad de uso y el bajo costo para crear una superficie con nanotopografías . Se grabaron obleas de silicio utilizando HF y se demostró que la adhesión celular se mejoró solo en un rango específico de rugosidad (20-50 nm). [7]
Además de crear topografía con señales físicas, se puede crear con señales químicas depositando selectivamente una solución de polímero en patrones sobre la superficie de un sustrato. Existen diferentes métodos para depositar las señales químicas. Dos métodos para dispensar soluciones químicas incluyen el patrón de rayas y la microdispensación piezoeléctrica.
Las películas de polímero con patrones de rayas se pueden formar sobre sustratos sólidos mediante el vertido de una solución de polímero diluida. Este método es relativamente fácil, económico y no tiene restricciones en cuanto a los materiales de andamiaje que se pueden utilizar. El procedimiento implica superponer horizontalmente placas de vidrio mientras se mantienen separadas verticalmente por un estrecho espacio lleno de una solución de polímero. La placa superior se mueve a una velocidad constante entre 60 y 100 μm/s. [28] Una fina película líquida de solución se forma continuamente en el borde del vidrio deslizante tras la evaporación del disolvente. Los patrones de rayas preparados a velocidades de 60, 70 y 100 μm/s crearon anchos y espaciamientos de ranuras de 2,2 y 6,1 μm, 3,6 y 8,4 μm, y 4,3 y 12,7 μm, respectivamente; el rango de alturas de las crestas fue de 50 a 100 nm. [28] Tsuruma, Tanaka et al. Se demostró que las células neuronales embrionarias cultivadas en una película recubierta con poli-L-lisina se unieron y se alargaron paralelamente a las rayas de solución de poli(ε-caprolactona)/cloroformo (1 g/L) con un ancho y espaciado de patrón estrechos (ancho: 2,2 μm, espaciado: 6,1 μm). [28] Sin embargo, las neuronas crecieron a lo largo del eje de los patrones con un ancho y espaciado amplios (ancho: 4,3 μm, espaciado: 12,7 μm). En promedio, las neuronas en las películas con patrón de rayas tenían menos neuritas por célula y neuritas más largas en comparación con las neuronas en películas sin patrón. Por lo tanto, los parámetros del patrón de rayas pueden determinar la dirección de crecimiento, la longitud de las neuritas y la cantidad de neuritas por célula. [28]
La microdispensación se utilizó para crear micropatrones en placas de cultivo de poliestireno dispensando gotitas de laminina adhesiva y soluciones de albúmina de suero bovino (BSA) no adhesiva. [29] El microdispensador es un elemento piezoeléctrico unido a una barra de empuje en la parte superior de un canal grabado en silicio, que tiene una entrada en cada extremo y una boquilla en el medio. El elemento piezoeléctrico se expande cuando se aplica voltaje, lo que hace que se dispense líquido a través de la boquilla. El microdispensador se mueve utilizando una mesa xy controlada por computadora. La resolución del micropatrón depende de muchos factores: viscosidad del líquido dispensado, paso de gota (la distancia entre el centro de dos gotas adyacentes en una línea o matriz) y el sustrato. [29] Con el aumento de la viscosidad, las líneas se vuelven más delgadas, pero si la viscosidad del líquido es demasiado alta, el líquido no puede ser expulsado. Calentar la solución crea líneas de proteína más uniformes. Aunque es necesaria cierta superposición de gotas para crear líneas continuas, la evaporación desigual puede causar una concentración desigual de proteína a lo largo de las líneas; Esto se puede evitar mediante una evaporación más suave modificando las propiedades de la solución dispensada.
En el caso de los patrones que contenían 0,5 mg/ml de laminina, creció una mayor proporción de neuritas en las líneas microdispensadas que entre las líneas. [29] En los patrones de proteína BSA de 10 mg/ml y 1 mg/ml y en los patrones de proteína BSA sin ácidos grasos, una cantidad significativa de neuritas evitó las líneas de proteína y creció entre las líneas. Por lo tanto, las líneas de BSA que contenían ácidos grasos fueron tan poco permisivas para el crecimiento de neuritas como las líneas que contenían BSA con ácidos grasos. Debido a que la microdispensación no requiere contacto directo con las superficies del sustrato, esta técnica puede utilizar superficies con micro o nanotopología delicada que podrían destruirse por contacto. Es posible variar la cantidad de proteína depositada dispensando más o menos gotitas. Una ventaja de la microdispensación es que se pueden crear patrones rápidamente en 5 a 10 minutos. Debido a que el microdispensador piezoeléctrico no requiere calentamiento, se pueden dispensar proteínas y fluidos sensibles al calor, así como células vivas. [29]
La selección del material del andamiaje es quizás la decisión más importante que se debe tomar. Debe ser biocompatible y biodegradable; además, debe poder incorporar cualquier señal física, química o biológica deseada, lo que en el caso de algunas señales químicas significa que debe tener un sitio disponible para unir químicamente péptidos y otras moléculas. Los materiales de andamiaje elegidos para los conductos de guía nerviosa son casi siempre hidrogeles. El hidrogel puede estar compuesto de polímeros biológicos o sintéticos. Tanto los polímeros biológicos como los sintéticos tienen sus fortalezas y debilidades. Es importante señalar que el material del conducto puede causar una recuperación inadecuada cuando (1) las tasas de degradación y reabsorción no coinciden con la tasa de formación de tejido, (2) las propiedades de tensión-deformación no se comparan bien con las del tejido neural, (3) cuando se produce una hinchazón degradante, que causa una deformación significativa, (4) se provoca una gran respuesta inflamatoria o (5) el material tiene baja permeabilidad. [30]
Los hidrogeles son una clase de biomateriales que son polímeros solubles en agua reticulados química o físicamente. Pueden ser degradables o no degradables según lo determine su química, pero es más deseable que sean degradables siempre que sea posible. Ha habido un gran interés en los hidrogeles para fines de ingeniería de tejidos, porque generalmente poseen una alta biocompatibilidad, propiedades mecánicas similares a las del tejido blando y la capacidad de ser inyectados como un líquido que se gelifica. [4] Cuando los hidrogeles están reticulados físicamente, deben depender de la separación de fases para la gelificación; la separación de fases depende de la temperatura y es reversible. [4] Algunas otras ventajas de los hidrogeles son que utilizan solo solventes acuosos no tóxicos, permiten la infusión de nutrientes y la salida de productos de desecho, y permiten que las células se ensamblen espontáneamente. [31] Los hidrogeles tienen una tensión interfacial baja, lo que significa que las células pueden migrar fácilmente a través del límite tejido-implante. [9] Sin embargo, con los hidrogeles es difícil formar una amplia gama de propiedades mecánicas o estructuras con un tamaño de poro controlado. [4]
Un polímero sintético puede ser degradable o no degradable. Para el propósito de la ingeniería de tejidos neuronales, se prefieren los materiales degradables siempre que sea posible, porque los efectos a largo plazo, como la inflamación y la cicatrización, podrían dañar gravemente la función nerviosa. La tasa de degradación depende del peso molecular del polímero, su cristalinidad y la relación entre las subunidades de ácido glicólico y ácido láctico. [4] Debido a un grupo metilo , el ácido láctico es más hidrófobo que el ácido glicólico, lo que hace que su hidrólisis sea más lenta. [4] Los polímeros sintéticos tienen propiedades mecánicas y tasas de degradación más manejables que se pueden controlar en un amplio rango, y eliminan la preocupación por la inmunogenicidad. [4] Actualmente, se utilizan muchos polímeros sintéticos diferentes en la ingeniería de tejidos neuronales. Sin embargo, los inconvenientes de muchos de estos polímeros incluyen la falta de biocompatibilidad y bioactividad, lo que impide que estos polímeros promuevan la adhesión, proliferación y diferenciación celular. [32] Los conductos sintéticos solo han tenido éxito clínicamente para la reparación de espacios de lesiones nerviosas muy cortos de menos de 1 a 2 cm. [33] Además, la regeneración nerviosa con estos conductos aún no ha alcanzado el nivel de recuperación funcional observado con los autoinjertos nerviosos. [30]
El colágeno es un componente importante de la matriz extracelular y se encuentra en los tejidos de sostén de los nervios periféricos. Se sintetizó un terpolímero (TERP) mediante copolimerización por radicales libres de sus tres monómeros y se entrecruzó con colágeno, creando un andamiaje de hidrogel híbrido biológico-sintético. [15] El terpolímero se basa en poli(NIPAAM), que se sabe que es un polímero amigable con las células. El TERP se utiliza tanto como un agente de reticulación para aumentar la robustez del hidrogel como un sitio para el injerto de péptidos bioactivos o factores de crecimiento, al reaccionar algunos de sus grupos acriloxisuccinimida con los grupos –NH2 en los péptidos o factores de crecimiento. [15] Debido a que el hidrogel de colágeno-terpolímero (colágeno-TERP) carece de un componente bioactivo, un estudio le adjuntó un péptido de adhesión celular común encontrado en la laminina (YIGSR) para mejorar sus propiedades de adhesión celular. [15]
Los polímeros de la familia PLGA incluyen el ácido poliláctico (PLA), el ácido poliglicólico (PGA) y su copolímero, el ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA). Los tres polímeros han sido aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos para su uso en diversos dispositivos. Estos polímeros son frágiles y no tienen regiones para la modificación química permisible; además, se degradan en masa en lugar de en superficie, lo que no es un proceso de degradación suave e ideal. [4] En un intento por superar la falta de funcionalidades, se han incorporado aminas libres a sus estructuras desde las que se pueden unir péptidos para controlar la adhesión y el comportamiento celular. [4]
El dextrano es un polisacárido derivado de bacterias; generalmente se produce mediante enzimas de ciertas cepas de leuconostoc o Streptococcus . Consiste en residuos de D-glucopiranosa unidos a α-1,6. Las perlas de hidrogel de dextrano reticuladas se han utilizado ampliamente como matrices de baja unión a proteínas para aplicaciones de cromatografía en columna y para tecnología de cultivo celular con microportadores. [34] Sin embargo, no ha sido hasta hace poco que los hidrogeles de dextrano se han investigado en aplicaciones de biomateriales y específicamente como vehículos de administración de fármacos. Una ventaja de usar dextrano en aplicaciones de biomateriales incluye su resistencia a la adsorción de proteínas y la adhesión celular, lo que permite determinar la adhesión celular específica mediante péptidos unidos deliberadamente de componentes de la matriz extracelular. [34] AEMA se copolimerizó con Dex-MA para introducir grupos de amina primaria para proporcionar un sitio para la unión de péptidos derivados de la matriz extracelular para promover la adhesión celular. Los péptidos se pueden inmovilizar mediante la química de acoplamiento sulfo-SMMC y péptidos con terminación de cisteína. La copolimerización de Dex-MA con AEMA permitió preservar la geometría macroporosa de los andamios además de promover las interacciones celulares. [34]
Se ha desarrollado un nuevo elastómero biodegradable y resistente a partir de poli(glicerol sebacato) (PGS) para su uso en la creación de un conducto guía para nervios. [30] El PGS se desarrolló originalmente para fines de ingeniería de tejidos blandos para imitar específicamente las propiedades mecánicas de la matriz extracelular. Se considera un elastómero porque es capaz de recuperarse de la deformación en entornos mecánicamente dinámicos y de distribuir eficazmente la tensión de manera uniforme a lo largo de los tejidos en regeneración en forma de microtensiones. El PGS se sintetiza mediante una reacción de policondensación de glicerol y ácido sebácico, que se puede procesar en estado fundido o con disolvente hasta obtener la forma deseada. El PGS tiene un módulo de Young de 0,28 MPa y una resistencia a la tracción máxima superior a 0,5 MPa. [30] El nervio periférico tiene un módulo de Young de aproximadamente 0,45 MPa, que es muy cercano al del PGS. Además, el PGS experimenta una degradación de la superficie, acompañada de pérdidas de masa lineal y resistencia durante la reabsorción. [30] Después de la implantación, se determinó que la vida media de degradación era de 21 días; la degradación completa se produjo el día 60. [30] El PGS experimenta una absorción mínima de agua durante la degradación y no tiene una hinchazón detectable; la hinchazón puede causar distorsión, lo que estrecha el lumen tubular y puede impedir la regeneración. Es ventajoso que el tiempo de degradación del PGS se pueda variar cambiando el grado de reticulación y la relación de ácido sebácico a glicerol. [30] En un estudio de Sundback et al. (2005), los conductos de PGS y PLGA implantados tuvieron respuestas tisulares tempranas similares; sin embargo, las respuestas inflamatorias de PLGA aumentaron más tarde, mientras que las respuestas inflamatorias de PGS continuaron disminuyendo. [30]
Los hidrogeles de polietilenglicol (PEG) son biocompatibles y se ha demostrado que son tolerados en muchos tipos de tejidos, incluido el SNC. Mahoney y Anseth formaron hidrogeles de PEG mediante la fotopolimerización de grupos de metacrilato unidos covalentemente a macrómeros de PEG degradables. La degradación del hidrogel se controló a lo largo del tiempo midiendo la resistencia mecánica (módulo de compresión) y el tamaño de malla promedio a partir de datos de la relación de hinchamiento. [35] Inicialmente, las cadenas de polímero estaban altamente reticuladas, pero a medida que avanzaba la degradación, los enlaces de éster se hidrolizaban, lo que permitía que el gel se hinchara; el módulo de compresión disminuía a medida que aumentaba el tamaño de la malla hasta que el hidrogel se disolvía por completo. Se demostró que las células precursoras neuronales podían fotoencapsularse y cultivarse en los geles de PEG con una muerte celular mínima. Debido a que el tamaño de la malla es inicialmente pequeño, el hidrogel bloquea las señales inflamatorias y otras señales inhibidoras del tejido circundante. A medida que aumenta el tamaño de la malla, el hidrogel puede servir como andamio para la regeneración de axones. [35]
Existen ventajas en el uso de polímeros biológicos en comparación con los polímeros sintéticos. Es muy probable que tengan una buena biocompatibilidad y se degraden fácilmente, porque ya están presentes en la naturaleza en alguna forma. Sin embargo, también existen varias desventajas. Tienen propiedades mecánicas difíciles de manejar y tasas de degradación que no se pueden controlar en un amplio rango. Además, siempre existe la posibilidad de que los materiales de origen natural puedan causar una respuesta inmunitaria o contener microbios. [4] En la producción de materiales de origen natural también habrá una variación de lote a lote en los procedimientos de aislamiento a gran escala que no se puede controlar. [16] Algunos otros problemas que afectan a los polímeros naturales son su incapacidad para soportar el crecimiento a través de grandes brechas de lesión debido a la posibilidad de colapso, formación de cicatrices y reabsorción temprana. [16] A pesar de todas estas desventajas, algunas de las cuales se pueden superar, los polímeros biológicos siguen demostrando ser la opción óptima en muchas situaciones.
El ácido polisiálico (PSA) es un material biocompatible y biorreabsorbible relativamente nuevo para conductos nerviosos artificiales. Es un homopolímero de residuos de ácido siálico unidos por enlaces α2,8 y una modificación postraduccional regulada dinámicamente de la molécula de adhesión celular neuronal (NCAM). Estudios recientes han demostrado que la NCAM polisialilada (poliSia-NCAM) promueve la regeneración en el sistema motor. [36] El PSA muestra estabilidad en condiciones de cultivo celular y permite la degradación inducida por enzimas. También se ha descubierto recientemente que el PSA está involucrado en procesos de dirección como la neuritogénesis, la búsqueda de vías axónicas y la migración de neuroblastos. [36] Los animales con PSA genéticamente eliminado expresan un fenotipo letal, que tiene una búsqueda de vías fallida; los nervios que conectan los dos hemisferios cerebrales eran aberrantes o faltaban. [36] Por lo tanto, el PSA es vital para el desarrollo adecuado del sistema nervioso.
El colágeno es el componente principal de la matriz extracelular y se ha utilizado ampliamente en la regeneración y reparación de nervios. Debido a su microgeometría y permeabilidad suaves, los geles de colágeno pueden permitir la difusión de moléculas a través de ellos. Las tasas de resorción de colágeno se pueden controlar mediante la reticulación del colágeno con compuestos polipoxídicos. [6] Además, los andamios de colágeno tipo I/III han demostrado una buena biocompatibilidad y pueden promover la proliferación de células de Schwann. Sin embargo, los conductos de colágeno llenos de células de Schwann utilizados para unir los espacios entre los nervios en ratas han demostrado una regeneración nerviosa sorprendentemente infructuosa en comparación con los autoinjertos nerviosos. [6] Esto se debe a que la biocompatibilidad no es el único factor necesario para una regeneración nerviosa exitosa; otros parámetros como el diámetro interno, la microtopografía interna, la porosidad, el espesor de la pared y la densidad de siembra de células de Schwann deberán examinarse en estudios futuros para mejorar los resultados obtenidos por estos geles de colágeno I/III. [6]
Se ha demostrado que las fibras de seda de araña promueven la adhesión celular, la proliferación y la vitalidad. Allmeling, Jokuszies et al. demostraron que las células de Schwann se adhieren rápidamente y con firmeza a las fibras de seda, creciendo en forma bipolar; las tasas de proliferación y supervivencia fueron normales en las fibras de seda. [37]
Utilizaron fibras de seda de araña para crear un conducto nervioso con células de Schwann y venas xenogénicas acelularizadas. Las células de Schwann formaron columnas a lo largo de las fibras de seda en un corto período de tiempo, y las columnas eran similares a las bandas de Bungner que crecen in vivo después de una lesión del SNP. [37] La seda de araña no se ha utilizado en ingeniería de tejidos hasta ahora debido a la naturaleza depredadora de las arañas y el bajo rendimiento de seda de las arañas individuales. Se ha descubierto que la especie Nephila clavipes produce seda que es menos inmunogénica que la seda del gusano de seda; tiene una resistencia a la tracción de 4 x 109 N/m, que es seis veces la resistencia a la rotura del acero. [37] Debido a que la seda de araña se degrada proteolíticamente, no hay un cambio en el pH del pH fisiológico durante la degradación. Otras ventajas de la seda de araña incluyen su resistencia a la descomposición fúngica y bacteriana durante semanas y el hecho de que no se hincha. Además, la estructura de la seda promueve la adhesión y migración celular. Sin embargo, la recolección de seda sigue siendo una tarea tediosa y la composición exacta varía entre especies e incluso entre individuos de la misma especie dependiendo de la dieta y el entorno. Ha habido intentos de fabricar seda de araña sintéticamente. Se necesitan más estudios para probar la viabilidad de utilizar un conducto nervioso de seda de araña in vitro e in vivo . [37]
Además de las arañas, los gusanos de seda son otra fuente de seda. La proteína de los gusanos de seda Bombyx mori es un núcleo de proteína fibroína rodeada de sericina, que es una familia de proteínas similares a pegamento. La fibroína se ha caracterizado como una cadena pesada con una secuencia hidrofóbica y cristalizable repetida: Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-X (X significa Ser o Tyr). La sericina circundante es más hidrofílica debido a muchos residuos polares, pero todavía tiene algunas porciones de lámina β hidrofóbicas. Las sedas se han utilizado durante mucho tiempo como suturas debido a su alta resistencia mecánica y flexibilidad, así como a su permeabilidad al agua y al oxígeno. Además, la fibroína de seda se puede manipular y esterilizar fácilmente. Sin embargo, el uso de la seda se detuvo cuando se informaron reacciones inmunológicas indeseables. Recientemente, se ha descubierto que la causa de los problemas inmunológicos radica únicamente en la sericina circundante. [38] Desde este descubrimiento, la seda sin la sericina se ha utilizado en muchas aplicaciones farmacéuticas y biomédicas. Debido a que es necesario eliminar la sericina de alrededor de la fibroína antes de que se pueda utilizar la seda, se necesita desarrollar un procedimiento eficiente para su eliminación, que se conoce como desgomado. Un método de desgomado utiliza una solución acuosa de Na2CO3 hirviendo , que elimina la sericina sin dañar la fibroína. Yang, Chen et al. demostraron que la fibroína de seda y el fluido de extracto de fibroína de seda muestran una buena biocompatibilidad con las células de Schwann, sin efectos citotóxicos sobre la proliferación. [38]
El quitosano y la quitina pertenecen a una familia de biopolímeros compuestos por subunidades de N-acetil-D-glucosamina y D-glucosamina unidas por enlaces β(1–4). [39] El quitosano se forma por N-desacetilación alcalina de la quitina, que es el segundo polímero natural más abundante después de la celulosa. [14] El quitosano es un polisacárido biodegradable que ha sido útil en muchas aplicaciones biomédicas, como agente quelante, portador de fármacos, membrana y aditivo para el tratamiento del agua. [11] El quitosano es soluble en soluciones acuosas diluidas, pero precipita en un gel a un pH neutro. [11] No favorece bien la adhesión y proliferación de células neuronales, pero se puede mejorar mediante la adhesión de péptidos derivados de la matriz extracelular. El quitosano también contiene propiedades mecánicas débiles, que son más difíciles de superar. [9]
El grado de acetilación (DA) del quitosano soluble varía de 0% a 60%, dependiendo de las condiciones de procesamiento. [39] Se realizó un estudio para caracterizar cómo la variación de DA afecta las propiedades del quitosano. La variación de DA se obtuvo utilizando anhídrido acético o hidrólisis alcalina . Se encontró que la disminución de la acetilación creó un aumento en la resistencia a la compresión. [39] La biodegradación se examinó mediante el uso de lisozima, que se sabe que es la principal responsable de degradar el quitosano in vivo al hidrolizar sus enlaces glucosídicos y es liberada por las células fagocíticas después de una lesión nerviosa. Los resultados revelan que hubo una pérdida de masa acelerada con DA intermedios, en comparación con DA altos y bajos durante el período de tiempo estudiado. [39] Cuando las células DRG se cultivaron en el quitosano N-acetilado, la viabilidad celular disminuyó con el aumento de DA. Además, el quitosano tiene una densidad de carga creciente con la disminución de DA, que es responsable de una mayor adhesión celular. [39] Por lo tanto, controlar la DA del quitosano es importante para regular el tiempo de degradación. Este conocimiento podría ayudar en el desarrollo de un conducto de guía nerviosa a partir del quitosano.
Recientemente se ha demostrado que los andamios de aragonito apoyan el crecimiento de neuronas de hipocampos de rata. Shany et al. (2006) demostraron que las matrices de aragonito pueden apoyar el crecimiento de redes astrocíticas in vitro e in vivo . Por lo tanto, los andamios de aragonito pueden ser útiles para la reparación y regeneración del tejido nervioso. Se plantea la hipótesis de que el Ca 2+ derivado del aragonito es esencial para promover la adherencia celular y el contacto célula-célula. Esto probablemente se lleva a cabo con la ayuda de moléculas de adhesión dependientes de Ca 2+ como las cadherinas. [40] Las matrices cristalinas de aragonito tienen muchas ventajas sobre los hidrogeles. Tienen poros más grandes, lo que permite un mejor crecimiento celular, y el material es bioactivo como resultado de la liberación de Ca 2+ , que promueve la adhesión y supervivencia celular. Además, las matrices de aragonito tienen mayor resistencia mecánica que los hidrogeles, lo que les permite soportar más presión cuando se presionan en un tejido lesionado. [40]
El alginato es un polisacárido que forma cadenas fácilmente; puede reticularse en sus grupos carboxílicos con cationes multivalentes como Cu2 + , Ca2 + o Al3 + para formar un hidrogel mecánicamente más estable. [41] Los alginatos de calcio forman polímeros que son biocompatibles y no inmunogénicos y se han utilizado en aplicaciones de ingeniería de tejidos. Sin embargo, no pueden soportar el crecimiento orientado longitudinalmente, que es necesario para la reconexión del extremo proximal con su objetivo. Para superar este problema, se han desarrollado hidrogeles capilares anisotrópicos (ACH). Se crean superponiendo soluciones acuosas de alginato de sodio con soluciones acuosas de cationes multivalentes en capas. [41] Después de la formación, los iones de electrolito se difunden en las capas de solución de polímero y un proceso convectivo disipativo hace que los iones precipiten, creando capilares. El proceso convectivo disipativo da como resultado la oposición de los gradientes de difusión y la fricción entre las cadenas de polielectrolitos . [41] Las paredes capilares están revestidas con el alginato metálico precipitado, mientras que el lumen está lleno con el agua extruida.
Prang et al. (2006) evaluaron la capacidad de los geles de ACH para promover el recrecimiento axonal dirigido en el SNC lesionado de mamíferos. Los iones multivalentes utilizados para crear los geles de ACH basados en alginato fueron iones de cobre, cuya difusión en las capas de alginato de sodio creó geles capilares anisotrópicos de estructura hexagonal. [41] Después de la precipitación, todo el gel fue atravesado por capilares orientados longitudinalmente. Los andamios de ACH promovieron la supervivencia de las células madre neuronales adultas y la regeneración axonal altamente orientada. [41] Este es el primer caso de uso de alginatos para producir geles capilares estructurados anisotrópicamente. Se necesitan estudios futuros para estudiar la estabilidad física a largo plazo de los andamios de ACH, porque la regeneración axonal del SNC puede llevar muchos meses; sin embargo, además de poder proporcionar soporte a largo plazo, los andamios también deben ser degradables. De todos los biopolímeros biológicos y sintéticos investigados por Prang et al. (2006), sólo los geles a base de agarosa pudieron compararse con la regeneración lineal causada por los andamios de ACH. Los estudios futuros también deberán investigar si los andamios de ACH permiten la reinervación del objetivo in vivo después de una lesión de la médula espinal. [41]
El ácido hialurónico (AH) es un biomaterial ampliamente utilizado como resultado de su excelente biocompatibilidad y su diversidad de funciones fisiológicas. Es abundante en la matriz extracelular (MEC), donde se une a grandes glicosaminoglicanos (GAG) y proteoglicanos a través de interacciones específicas entre el AH y las proteínas. El AH también se une a los receptores de la superficie celular, como el CD44, lo que da como resultado la activación de cascadas de señalización intracelular que regulan la adhesión y la motilidad celular y promueven la proliferación y la diferenciación. [42] También se sabe que el AH favorece la angiogénesis porque sus productos de degradación estimulan la proliferación y la migración de las células endoteliales. Por lo tanto, el AH desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de los procesos normales necesarios para la supervivencia de los tejidos. El AH sin modificar se ha utilizado en aplicaciones clínicas como la cirugía ocular, la cicatrización de heridas y la cirugía plástica. [42] El AH se puede reticular para formar hidrogeles. En un estudio realizado por Hou et al., se implantaron hidrogeles de HA modificados con laminina o sin modificar en una lesión del sistema nervioso central de un adulto y se evaluó su capacidad para inducir la formación de tejido neural. Demostraron la capacidad de favorecer el crecimiento celular y la angiogénesis, además de inhibir la formación de cicatrices gliales. Además, los hidrogeles de HA modificados con laminina pudieron promover la extensión de las neuritas. [42] Estos resultados respaldan a los geles de HA como un biomaterial prometedor para un conducto de guía nerviosa.
Además del material de andamiaje y las señales físicas, también se pueden incorporar señales biológicas en un conducto nervioso bioartificial en forma de células. En el sistema nervioso hay muchos tipos diferentes de células que ayudan a sustentar el crecimiento y el mantenimiento de las neuronas. Estas células se denominan colectivamente células gliales. Se han investigado las células gliales en un intento de comprender los mecanismos detrás de sus capacidades para promover la regeneración axonal. Se analizan tres tipos de células gliales: células de Schwann, astrocitos y células de envoltura olfatoria. Además de las células gliales, las células madre también tienen un beneficio potencial para la reparación y la regeneración porque muchas pueden diferenciarse en neuronas o células gliales. Este artículo analiza brevemente el uso de células madre adultas, transdiferenciadas, mesenquimales, ectomesenquimales, neurales y progenitoras neurales.
Las células gliales son necesarias para sustentar el crecimiento y el mantenimiento de las neuronas en el sistema nervioso periférico y central. La mayoría de las células gliales son específicas del sistema nervioso periférico o central. Las células de Schwann se encuentran en el sistema nervioso periférico, donde mielinizan los axones de las neuronas. Los astrocitos son específicos del sistema nervioso central; proporcionan nutrientes, soporte físico y aislamiento a las neuronas. También forman la barrera hematoencefálica. Sin embargo, las células envolventes olfatorias cruzan el límite SNC-SNP, porque guían a las neuronas receptoras olfativas desde el SNP hasta el SNC.
Las células de Schwann (SC) son cruciales para la regeneración de los nervios periféricos; desempeñan funciones tanto estructurales como funcionales. Las células de Schwann son responsables de participar tanto en la degeneración walleriana como en las bandas de Bungner. Cuando un nervio periférico se daña, las células de Schwann modifican su morfología, comportamiento y proliferación para involucrarse en la degeneración walleriana y las bandas de Bungner. [38] En la degeneración walleriana, las células de Schwann crecen en columnas ordenadas a lo largo del tubo endoneurial, creando una banda de Bungner (boB) que protege y preserva el canal endoneurial. Además, liberan factores neurotróficos que mejoran el recrecimiento junto con los macrófagos. Existen algunas desventajas en el uso de células de Schwann en la ingeniería de tejidos neuronales; por ejemplo, es difícil aislar selectivamente las células de Schwann y muestran una proliferación deficiente una vez aisladas. Una forma de superar esta dificultad es inducir artificialmente otras células, como las células madre, a fenotipos similares a los de las SC. [43]
Eguchi et al. (2003) han investigado el uso de campos magnéticos para alinear las células de Schwann. Utilizaron un imán superconductor de tipo horizontal, que produce un campo de 8 T en su centro. Dentro de las 60 horas de exposición, las células de Schwann se alinearon en paralelo al campo; durante el mismo intervalo, las células de Schwann no expuestas se orientaron de manera aleatoria. Se plantea la hipótesis de que las diferencias en la susceptibilidad al campo magnético de los componentes de la membrana y los elementos del citoesqueleto pueden causar la orientación magnética. [44] Las fibras de colágeno también se expusieron al campo magnético y, en 2 horas, se alinearon perpendicularmente al campo magnético, mientras que las fibras de colágeno formaron un patrón de malla aleatorio sin exposición al campo magnético. Cuando se cultivaron en las fibras de colágeno, las células de Schwann se alinearon a lo largo del colágeno orientado magnéticamente después de dos horas de exposición al campo magnético de 8 T. En contraste, las células de Schwann se orientaron aleatoriamente en las fibras de colágeno sin exposición al campo magnético. De esta manera, el cultivo sobre fibras de colágeno permitió que las células de Schwann se orientaran perpendicularmente al campo magnético y mucho más rápido. [44]
Estos hallazgos pueden ser útiles para alinear las células de Schwann en una lesión del sistema nervioso y promover la formación de bandas de Bungner, que son cruciales para mantener el tubo endoneural que guía a los axones que vuelven a crecer hacia sus objetivos. Es casi imposible alinear las células de Schwann mediante técnicas físicas externas; por lo tanto, el descubrimiento de una técnica alternativa para la alineación es significativo. Sin embargo, la técnica desarrollada aún tiene sus desventajas, a saber, que se necesita una cantidad considerable de energía para mantener el campo magnético durante períodos prolongados.
Se han realizado estudios en intentos de mejorar la capacidad migratoria de las células de Schwann. La migración de las células de Schwann está regulada por integrinas con moléculas de la matriz extracelular, como la fibronectina y la laminina. Además, se sabe que la molécula de adhesión celular neural ( NCAM ) mejora la motilidad de las células de Schwann in vitro . [45] La NCAM es una glicoproteína que se expresa en las membranas axónicas y de las células de Schwann. El ácido polisiálico (PSA) se sintetiza en la NCAM por la polisialiltransferasa (PST) y la sialiltransferasa X (STX). [45] Durante el desarrollo del SNC, la expresión de PSA en la NCAM se regula positivamente hasta las etapas posnatales. Sin embargo, en el cerebro adulto, el PSA solo se encuentra en regiones con alta plasticidad . La expresión de PSA no ocurre en las células de Schwann.
Lavdas et al. (2006) investigaron si la expresión sostenida de PSA en las células de Schwann mejora su migración. Las células de Schwann se transdujeron con un vector retroviral que codifica STX para inducir la expresión de PSA. Las células de Schwann que expresaban PSA obtuvieron una motilidad mejorada como se demostró en un ensayo de puenteo de brecha y después del injerto en cultivos de cortes de prosencéfalo postnatal. [45] La expresión de PSA no alteró la diferenciación molecular y morfológica. Las células de Schwann que expresaban PSA pudieron mielinizar los axones del SNC en cortes cerebelosos, lo que normalmente no es posible in vivo . Es de esperar que estas células de Schwann que expresan PSA puedan migrar por todo el SNC sin pérdida de capacidades mielinizantes y puedan volverse útiles para la regeneración y mielinización de axones en el sistema nervioso central. [45]
Los astrocitos son células gliales que abundan en el sistema nervioso central. Son cruciales para el soporte metabólico y trófico de las neuronas; además, los astrocitos proporcionan amortiguación de iones y eliminación de neurotransmisores. Los axones en crecimiento son guiados por señales creadas por los astrocitos; por lo tanto, los astrocitos pueden regular la búsqueda de rutas de neuritas y, posteriormente, la formación de patrones en el cerebro en desarrollo. [40] La cicatriz glial que se forma después de una lesión en el sistema nervioso central está formada por astrocitos y fibroblastos ; es el obstáculo más importante para la regeneración. La cicatriz glial está formada por astrocitos hipertrofiados, tejido conectivo y matriz extracelular. Dos objetivos de la ingeniería de tejidos neuronales son comprender la función de los astrocitos y desarrollar el control sobre el crecimiento astrocítico. Los estudios de Shany et al. (2006) han demostrado que las tasas de supervivencia de los astrocitos aumentan en matrices de aragonito 3D en comparación con los cultivos celulares 2D convencionales. La capacidad de los procesos celulares de extenderse a través de curvas y poros permite la formación de múltiples capas celulares con configuraciones tridimensionales complejas.
Las tres formas distintas por las que las células adquirieron una forma 3D son: [40]
En el cultivo celular convencional, el crecimiento se restringe a un plano, lo que provoca la formación de monocapas con la mayoría de las células en contacto con la superficie; sin embargo, la curvatura 3D de la superficie de aragonito permite que se desarrollen múltiples capas y que los astrocitos que están muy separados entre sí entren en contacto. Es importante promover la formación del proceso de manera similar a las condiciones 3D in vivo , porque la morfología del proceso astrocítico es esencial para guiar la direccionalidad de los axones en regeneración. [40] La topografía de aragonito proporciona una alta relación área superficial a volumen y carece de bordes, lo que conduce a una reducción del efecto de borde del cultivo. [40] Las matrices cristalinas como el aragonito mencionado aquí permiten la promoción de una formación de tejido 3D complejo que se aproxima a las condiciones in vivo .
El sistema olfativo primario de los mamíferos ha conservado la capacidad de regenerarse continuamente durante la edad adulta. [46] Las neuronas receptoras olfativas tienen una vida media de 6 a 8 semanas y, por lo tanto, deben ser reemplazadas por células diferenciadas de las células madre que se encuentran dentro de una capa en la base del epitelio cercano. Las nuevas neuronas receptoras olfativas deben proyectar sus axones a través del SNC hasta un bulbo olfatorio para ser funcionales. El crecimiento axonal está guiado por la composición glial y la citoarquitectura del bulbo olfatorio, además de la presencia de células envolventes olfatorias (OEC). [46]
Se postula que las OEC se originan en la placa olfatoria , lo que sugiere un origen de desarrollo diferente al de otras microglias similares del sistema nervioso.
Otro concepto interesante es que las OEC se encuentran tanto en las porciones del sistema nervioso periférico como central del sistema olfativo primario, es decir, el epitelio y el bulbo olfatorios. [46]
Las células OEC son similares a las células de Schwann en que proporcionan una regulación positiva del receptor p75 de NGF de baja afinidad después de una lesión; sin embargo, a diferencia de las células de Schwann, producen niveles más bajos de neurotrofinas . Varios estudios han demostrado evidencia de que las células OEC pueden apoyar la regeneración de axones lesionados, pero estos resultados a menudo no se pueden reproducir. [46] De todos modos, las células OEC se han investigado a fondo en relación con las lesiones de la médula espinal, la esclerosis lateral amiotrófica y otras enfermedades neurodegenerativas. Los investigadores sugieren que estas células poseen una capacidad única para remielinizar las neuronas lesionadas. [47]
Las OEC tienen propiedades similares a las de los astrocitos , [48] ambos identificados como susceptibles a la infección viral. [47] [48]
Las células madre se caracterizan por su capacidad de autorrenovarse durante un tiempo prolongado y aún así mantener la capacidad de diferenciarse a lo largo de uno o más linajes celulares. Las células madre pueden ser unipotentes, multipotentes o pluripotentes, lo que significa que pueden diferenciarse en uno, varios o todos los tipos de células, respectivamente. [49] Las células madre pluripotentes pueden convertirse en células derivadas de cualquiera de las tres capas germinales embrionarias. [49] Las células madre tienen la ventaja sobre las células gliales porque pueden proliferar más fácilmente en cultivo. Sin embargo, sigue siendo difícil diferenciar preferentemente estas células en diversos tipos de células de una manera ordenada. [4] Otra dificultad con las células madre es la falta de una definición bien definida de células madre más allá de las células madre hematopoyéticas (HSC). Cada "tipo" de célula madre tiene más de un método para identificar, aislar y expandir las células; esto ha causado mucha confusión porque todas las células madre de un "tipo" (neuronal, mesenquimal, retinal) no necesariamente se comportan de la misma manera en condiciones idénticas.
Las células madre adultas no pueden proliferar y diferenciarse tan eficazmente in vitro como lo hacen in vivo . Las células madre adultas pueden provenir de muchas ubicaciones de tejido diferentes, pero es difícil aislarlas porque se definen por el comportamiento y no por marcadores de superficie. Todavía se debe desarrollar un método para distinguir claramente entre células madre y las células diferenciadas que las rodean. Sin embargo, los marcadores de superficie aún se pueden usar hasta cierto punto para eliminar la mayoría de las células diferenciadas no deseadas. La plasticidad de las células madre es la capacidad de diferenciarse a través de los límites de la línea germinal embrionaria. Sin embargo, la presencia de plasticidad ha sido muy discutida. Algunos afirman que la plasticidad es causada por la heterogeneidad entre las células o eventos de fusión celular. Actualmente, las células se pueden diferenciar a través de líneas celulares con rendimientos que varían del 10% al 90% dependiendo de las técnicas utilizadas. [49] Se necesitan más estudios para estandarizar el rendimiento con transdiferenciación. La transdiferenciación de células madre multipotentes es un medio potencial para obtener células madre que no están disponibles o no se obtienen fácilmente en el adulto. [4]
Las células madre mesenquimales son células madre adultas que se encuentran en la médula ósea; son capaces de diferenciarse en linajes de origen mesodérmico. Algunos ejemplos de tejido que forman son hueso , cartílago , grasa y tendón . Las MSC se obtienen por aspiración de médula ósea. Muchos factores promueven el crecimiento de las MSC, incluidos: factor de crecimiento derivado de plaquetas , factor de crecimiento epidérmico β y factor de crecimiento similar a la insulina-1 . Además de sus vías de diferenciación normales, las MSC pueden transdiferenciarse a lo largo de linajes no mesenquimales como astrocitos, neuronas y células mielinizantes del SNP. Las MSC son potencialmente útiles para las estrategias de regeneración nerviosa porque: [50]
Keilhoff et al. (2006) realizaron un estudio comparando la capacidad de regeneración nerviosa de las MSC no diferenciadas y transdiferenciadas con las células de Schwann en injertos musculares desvitalizados que unían un espacio de 2 cm en el nervio ciático de la rata. Todas las células eran autólogas. Las MSC transdiferenciadas se cultivaron en una mezcla de factores para promover la formación de células similares a las células de Schwann. Las MSC no diferenciadas no demostraron capacidad regenerativa, mientras que las MSC transdiferenciadas mostraron cierta capacidad regenerativa, aunque no alcanzó la capacidad de las células de Schwann. [50]
La dificultad de aislar las células de Schwann y posteriormente inducir la proliferación es un gran obstáculo. Una solución es inducir selectivamente células como las células madre ectomesenquimales (EMSC) en fenotipos similares a las células de Schwann. Las EMSC son células de la cresta neural que migran desde la cresta neural craneal al primer arco branquial durante el desarrollo temprano del sistema nervioso periférico. [43] Las EMSC son multipotentes y poseen una capacidad de autorrenovación. Se las puede considerar células progenitoras de Schwann porque están asociadas con el ganglio de la raíz dorsal y el desarrollo del nervio motor. La diferenciación de las EMSC parece estar regulada por programas genéticos intrínsecos y señales extracelulares en el entorno circundante. [43] Las células de Schwann son la fuente de factores neurotróficos y neurotróficos esenciales para la regeneración de los nervios y un andamiaje para guiar el crecimiento. Nie, Zhang et al. realizaron un estudio que investigó los beneficios de cultivar EMSC dentro de conductos PLGA. La adición de foskolina y BPE a un cultivo de EMSC provocó la formación de procesos celulares alargados, lo cual es común en las células de Schwann in vitro . [43] Por lo tanto, la foskolina y el BPF pueden inducir la diferenciación en fenotipos similares a las células de Schwann. El BPE contiene las citocinas GDNF , factor de crecimiento básico de fibroblastos y factor de crecimiento derivado de plaquetas , que causan la diferenciación y proliferación de células gliales y de Schwann mediante la activación de las quinasas MAP . Cuando se implantaron en los conductos PLGA, las EMSC mantuvieron la supervivencia a largo plazo y promovieron la regeneración de los nervios periféricos a través de un espacio de 10 mm, que generalmente demuestra poca o ninguna regeneración. Los axones mielinizados estaban presentes dentro de los injertos y se formaron láminas basales dentro de la mielina. Estas observaciones sugieren que las EMSC pueden promover la mielinización de las fibras nerviosas regeneradas dentro del conducto.
La inserción de neuronas en un conducto nervioso bioartificial parece ser el método más obvio para reemplazar nervios dañados; sin embargo, las neuronas no pueden proliferar y a menudo tienen una vida corta en cultivo. Por lo tanto, las células progenitoras neuronales son candidatas más prometedoras para reemplazar neuronas dañadas y degeneradas porque se auto-renuevan, lo que permite la producción in vitro de muchas células con un mínimo material donante. [31] Para confirmar que las nuevas neuronas formadas a partir de células progenitoras neuronales son parte de una red funcional, se requiere la presencia de formación de sinapsis. Un estudio de Ma, Fitzgerald et al. es la primera demostración de la formación de redes neuronales y sinapsis funcionales derivadas de células madre y progenitoras neuronales murinas en una matriz de colágeno 3D. Las células progenitoras neuronales se expandieron y se diferenciaron espontáneamente en neuronas excitables y formaron sinapsis; además, conservaron la capacidad de diferenciarse en los tres linajes de tejido neuronal. [31] También se demostró que no solo se producía un reciclaje activo de vesículas sinápticas, sino que también se formaban conexiones excitatorias e inhibitorias capaces de generar potenciales de acción de forma espontánea. [31] Por tanto, las células progenitoras neuronales son una fuente viable y relativamente ilimitada para la creación de neuronas funcionales.
Las células madre neurales (CMN) tienen la capacidad de autorenovarse y diferenciarse en linajes neuronales y gliales. Se han desarrollado muchos métodos de cultivo para dirigir la diferenciación de las CMN; sin embargo, la creación de biomateriales para dirigir la diferenciación de las CMN se considera una tecnología más relevante y utilizable clínicamente. [ cita requerida ] Un enfoque para desarrollar un biomaterial para dirigir la diferenciación de las CMN es combinar componentes de la matriz extracelular (ECM) y factores de crecimiento. Un estudio muy reciente de Nakajima, Ishimuro et al. examinó los efectos de diferentes pares moleculares que consisten en un factor de crecimiento y un componente de la ECM en la diferenciación de las CMN en astrocitos y células neuronales. Los componentes de la ECM investigados fueron la laminina-1 y la fibronectina, que son componentes naturales de la ECM, y ProNectin F plus (Pro-F) y ProNectin L (Pro-L), que son componentes artificiales de la ECM, y poli(etilenimina) (PEI). Los factores neurotróficos utilizados fueron el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos -2 (FGF-2), el factor de crecimiento nervioso (NGF), la neurotrofina-3 (NT-3) y el factor neurotrófico ciliar (CNTF). Las combinaciones de pares se inmovilizaron en matrices de células, en las que se cultivaron las células madre neurales. Después de 2 días en cultivo, las células se tiñeron con anticuerpos contra nestina , β- tubulina III y GFAP , que son marcadores de células madre neurales, células neuronales y astrocitos, respectivamente. [51] Los resultados proporcionan información valiosa sobre combinaciones ventajosas de componentes de la matriz extracelular y factores de crecimiento como un método práctico para desarrollar un biomaterial para dirigir la diferenciación de las células madre neurales. [51]
En la actualidad, los factores neurotróficos se están estudiando intensamente para su uso en conductos nerviosos bioartificiales porque son necesarios in vivo para dirigir el crecimiento y la regeneración de los axones. En los estudios, los factores neurotróficos se utilizan normalmente junto con otras técnicas, como señales biológicas y físicas creadas mediante la adición de células y topografías específicas. Los factores neurotróficos pueden o no estar inmovilizados en la estructura del andamiaje, aunque se prefiere la inmovilización porque permite la creación de gradientes permanentes y controlables. En algunos casos, como los sistemas de administración de fármacos neuronales , se inmovilizan de forma flexible de modo que se puedan liberar de forma selectiva en momentos específicos y en cantidades específicas. La administración de fármacos es el siguiente paso más allá de la adición básica de factores de crecimiento a los conductos de guía de los nervios.
Muchos de los biomateriales utilizados para los conductos de guía de los nervios son materiales biomiméticos . Los materiales biomiméticos son materiales que han sido diseñados de tal manera que provocan respuestas celulares específicas mediadas por interacciones con péptidos unidos a estructuras de proteínas de la matriz extracelular; esencialmente, la incorporación de péptidos que se unen a las células en los biomateriales a través de una modificación química o física. [52]
El sinergismo ocurre a menudo cuando se combinan dos elementos; es una interacción entre dos elementos que causa un efecto mayor que los efectos combinados de cada elemento por separado. El sinergismo es evidente en la combinación de material de andamiaje y topografía con terapias celulares, factores neurotróficos y materiales biomiméticos. La investigación del sinergismo es el siguiente paso después de que las técnicas individuales hayan demostrado ser exitosas por sí mismas. Las combinaciones de estos diferentes factores deben estudiarse cuidadosamente para optimizar los efectos sinérgicos.
Se planteó la hipótesis de que las interacciones entre los factores neurotróficos podrían alterar las concentraciones óptimas de cada factor. Si bien la supervivencia celular y el mantenimiento del fenotipo son importantes, el énfasis de la evaluación estaba en la extensión de las neuritas. Se presentó una combinación de NGF , factor neurotrófico derivado de la línea celular glial ( GDNF ) y factor neurotrófico ciliar ( CNTF ) a cultivos de ganglios de la raíz dorsal in vitro . Se utilizó un factor de cada familia neurotrófica. [53] Se determinó que no hay una diferencia en la concentración óptima individual y la concentración óptima combinatoria; sin embargo, alrededor del día 5 o 6 las neuritas cesaron la extensión y comenzaron a degradarse. Se planteó la hipótesis de que esto se debía a la falta de un nutriente crítico o de gradientes adecuados; estudios previos han demostrado que los factores de crecimiento pueden optimizar mejor la extensión de las neuritas cuando se presentan en gradientes. [53] Los estudios futuros sobre combinaciones de factores neurotróficos deberán incluir gradientes.
Las moléculas de adhesión celular (CAM) y los factores neurotróficos integrados en matrices biocompatibles son un concepto relativamente nuevo que se está investigando. [54] Las CAM de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF), que incluye L1/NgCAM y neurofascina, son particularmente prometedoras, porque se expresan en el sistema nervioso en desarrollo en neuronas o células de Schwann. Se sabe que sirven como señales de guía y median la diferenciación neuronal. Sin embargo, los factores neurotróficos como NGF y el factor de diferenciación de crecimiento 5 (GDF-5) están bien establecidos como promotores de la regeneración in vivo . Un estudio reciente de Niere, Brown et al. investigó los efectos sinérgicos de la combinación de L1 y neurofascina con NGF y GDF-5 en neuronas DRG en cultivo; esta combinación mejoró el crecimiento de las neuritas. Se demostró una mejora adicional combinando L1 y neurofascina en una proteína de fusión artificial, que mejora la eficiencia ya que los factores no se administran individualmente. [54] No sólo se pueden utilizar diferentes señales, sino que incluso se pueden fusionar en una única señal "nueva".
No se ha explorado el efecto de presentar múltiples tipos de estímulos, como señales químicas, físicas y biológicas, sobre la diferenciación de células progenitoras neuronales. Se realizó un estudio en el que se presentaron tres estímulos diferentes a células progenitoras del hipocampo de ratas adultas (AHPC): astrocitos tipo 1 de rata posnatal (biológicos), laminina (químicos) y sustrato micropatrón (físicos). [55] Más del 75 % de las AHPC se alinearon dentro de los 20° de los surcos en comparación con el crecimiento aleatorio en los sustratos sin patrón. [55] Cuando las AHPC se cultivaron en sustratos micropatrón con astrocitos, el crecimiento se vio influenciado por los astrocitos que se habían alineado con los surcos; es decir, las AHPC extendieron procesos a lo largo de los filamentos del citoesqueleto astrocítico. Sin embargo, la alineación no fue tan significativa como la observada por las AHPC en cultivo solo con el sustrato micropatrón. Para evaluar los diferentes fenotipos expresados como resultado de la diferenciación, las células se tiñeron con anticuerpos para la β-tubulina de clase III (TuJI), la proteína que interactúa con el receptor (RIP) y la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), que son marcadores de neuronas tempranas, oligodendrocitos y astrocitos, respectivamente. La mayor cantidad de diferenciación se observó con las AHPC cultivadas en sustratos con patrones con astrocitos. [55]
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