Las lisinas , también conocidas como endolisinas o mureína hidrolasas , son enzimas hidrolíticas producidas por bacteriófagos con el fin de escindir la pared celular del huésped durante la etapa final del ciclo lítico . Las lisinas son enzimas altamente evolucionadas que pueden apuntar a uno de los cinco enlaces del peptidoglicano (mureína), el componente principal de las paredes celulares bacterianas, que permite la liberación de viriones descendientes de la célula lisada. Las arqueas que contienen paredes celulares también son lisadas por lisinas especializadas que escinden pseudomureínas , [2] mientras que la mayoría de los virus de las arqueas emplean mecanismos alternativos. [3] De manera similar, no todos los bacteriófagos sintetizan lisinas: algunos pequeños fagos de ADN y ARN monocatenarios producen proteínas de membrana que activan los mecanismos autolíticos del huésped , como las autolisinas . [4]
Las lisinas se utilizaron por primera vez con fines terapéuticos en 2001 en el laboratorio Fischetti (ver más abajo) y ahora se utilizan como agentes antibacterianos debido a su alta eficacia y especificidad en comparación con los antibióticos , que son susceptibles a la resistencia bacteriana. [5] Debido a que las lisinas son esenciales para la supervivencia de los bacteriófagos, la resistencia a las lisinas es un evento extremadamente raro. Durante los más de 20 años de desarrollo de la lisina como terapéutico, no se ha observado resistencia, incluso cuando la resistencia es forzada por experimentos de mutagénesis.
Las lisinas de fagos de ADN de doble cadena tienden a encontrarse dentro del rango de 25 a 40 k Da en términos de tamaño. Una excepción notable es la endolisina estreptocócica PlyC, que tiene 114 kDa. PlyC no sólo es la lisina más grande y potente, sino también estructuralmente única, ya que está compuesta de dos productos genéticos diferentes, PlyCA y PlyCB, con una proporción de ocho subunidades de PlyCB para cada PlyCA en su conformación activa. [6]
Todas las demás lisinas son monoméricas y comprenden dos dominios separados por una región conectora corta. Para las lisinas de bacterias grampositivas, el dominio N-terminal cataliza la hidrólisis del peptidoglicano, mientras que el dominio C-terminal se une al sustrato de la pared celular.
El dominio catalítico es responsable de la ruptura de los enlaces de peptidoglicano. Funcionalmente se pueden distinguir cinco tipos de dominio catalítico de lisina:
El peptidoglicano está formado por aminoácidos y azúcares reticulados que forman aminoácidos alternados: N-acetilglucosamina (NAG) y ácido N-acetilmurámico (NAM). Las lisinas endo-β-N-acetilglucosaminidasa escinden las NAG, mientras que las lisinas N-acetilmuramidasa (lisinas similares a lisozimas) escinden las NAM. Las lisinas endopeptidasas escinden cualquiera de los enlaces peptídicos entre aminoácidos, mientras que las lisinas N-acetilmuramoil-l-alanina amidasa (o simplemente lisinas amidasa) hidrolizan el enlace amida entre los restos de azúcar y aminoácidos. Finalmente, las lisinas endopeptidasas γ-d-glutaminil-l-lisina recientemente descubiertas escinden el enlace gamma entre los residuos de D-glutamina y L-lisina. Como es el caso de las autolisinas , la confusión inicial en torno a la especificidad de escisión de estas enzimas individuales ha llevado a algunas atribuciones erróneas del nombre "lisozima" a proteínas sin esta actividad. [7]
Por lo general, dos o más dominios catalíticos diferentes están unidos a un único dominio de unión celular. Esto es típico en muchas lisinas estafilocócicas, así como en la holoenzima PlyC estreptocócica, que contiene dos dominios catalíticos. [6] [8] Los dominios catalíticos están altamente conservados en lisinas de fagos de la misma clase. [5]
El dominio de unión celular (CBD) se une a un sustrato específico que se encuentra en la pared celular de la bacteria huésped, generalmente un carbohidrato. A diferencia del dominio catalítico, el dominio de unión celular es variable, lo que permite una gran especificidad y disminuye la resistencia bacteriana. [9] La afinidad de unión al sustrato de la pared celular tiende a ser alta, posiblemente para secuestrar en fragmentos de la pared celular cualquier enzima libre, que podría competir con la progenie de fagos al infectar bacterias huésped adyacentes. [10]
Se ha propuesto que el principal mecanismo de evolución en las lisinas de fagos es el intercambio de unidades modulares, un proceso mediante el cual se han intercambiado diferentes dominios catalíticos y de unión celular entre lisinas, lo que habría dado lugar a nuevas combinaciones tanto de unión bacteriana como de unión catalítica. especificidades. [11]
El dominio catalítico de lisina digiere el peptidoglicano localmente a un ritmo elevado, lo que provoca agujeros en la pared celular. Dado que la pared celular de peptidoglicano reticulado es el único mecanismo que previene la explosión espontánea de células bacterianas debido a la alta presión interna (3 a 5 atmósferas), la digestión enzimática por lisinas causa irreversiblemente una lisis hipotónica. Teóricamente, debido a las propiedades catalíticas de las lisinas de los fagos, una sola enzima sería suficiente para matar a la bacteria huésped rompiendo el número necesario de enlaces, aunque esto aún no se ha demostrado. [5] El trabajo de Loessner et al sugiere que la escisión normalmente se logra mediante la acción conjunta de múltiples moléculas de lisina en una región local de la pared celular del huésped. [10] La alta afinidad de unión al sustrato de la pared celular (cercana a la de la IgG por su sustrato) de cada lisina parece ser la razón por la que se requieren múltiples moléculas, ya que cada lisina se une tan fuertemente a la pared celular que no puede rompe suficientes enlaces para causar la lisis por sí mismo. [10]
Para llegar a la pared celular, las lisinas del fago tienen que atravesar la membrana celular. Sin embargo, generalmente carecen de un péptido señal que les permita hacerlo. Para solucionar este problema, los virus fagos sintetizan otra proteína llamada holina que se une a la membrana celular y hace agujeros en ella (de ahí su nombre), permitiendo que las lisinas lleguen a la matriz de peptidoglicano. La holina prototípica es la proteína del fago lambda S, que ayuda a la proteína del fago lambda R (lisina). Todas las holinas se incrustan en la membrana celular y contienen al menos dos dominios helicoidales transmembrana. Se cree que el proceso de creación de agujeros se logra mediante la oligomerización de holina en un momento específico en el que se liberarán los viriones de la progenie. [4] [12]
Las lisinas de fagos son generalmente específicas de especies o subespecies, lo que significa que solo son efectivas contra las bacterias a partir de las cuales fueron producidas. Si bien algunas lisinas sólo actúan sobre las paredes celulares de varios filotipos bacterianos, se han encontrado algunas lisinas de amplio espectro. [13] Asimismo, se conocen algunas lisinas termoestables, lo que las hace más fáciles de utilizar en biotecnología. [14] En cuanto a su uso como agentes antibacterianos, se ha encontrado que las lisinas son efectivas principalmente contra las bacterias Gram-positivas , ya que las bacterias Gram-negativas poseen una membrana externa que evita que las moléculas de lisina extracelulares digieran el peptidoglicano. [5] Sin embargo, las lisinas con actividad contra bacterias Gram-negativas, como OBPgp279 , han despertado interés como posibles terapias. [15]
Uno de los aspectos más problemáticos del uso de lisinas de fagos como agentes antimicrobianos es la potencial inmunogenicidad de estas enzimas. A diferencia de la mayoría de los antibióticos, las proteínas son propensas al reconocimiento y la unión de los anticuerpos, lo que significa que las lisinas podrían ser ineficaces en el tratamiento de infecciones bacterianas o incluso peligrosas, lo que podría provocar una respuesta inmune sistémica o una tormenta de citocinas . No obstante, los datos experimentales de suero de conejo inmunológicamente rico mostraron que el suero hiperinmune ralentiza pero no bloquea la actividad de la lisina neumocócica Cpl-1. [dieciséis]
Las lisinas de fagos se han probado con éxito en modelos animales para controlar bacterias patógenas resistentes a los antibióticos que se encuentran en las membranas mucosas y en la sangre. La principal ventaja de las lisinas en comparación con los antibióticos no es sólo la baja resistencia bacteriana sino también la alta especificidad hacia el patógeno objetivo y la baja actividad hacia la flora bacteriana normal del huésped . [5]
Las lisinas se utilizaron terapéuticamente por primera vez en animales en 2001, en una publicación en la que ratones colonizados por vía oral con Streptococcus pyogenes fueron descolonizados con una dosis única de lisina PlyC administrada por vía oral. [17]
