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Ligación (biología molecular)

Una ligadura de extremo adhesivo

La ligadura es la unión de dos fragmentos de ácido nucleico mediante la acción de una enzima. Es un procedimiento de laboratorio esencial en la clonación molecular de ADN, mediante el cual se unen fragmentos de ADN para crear moléculas de ADN recombinante (como cuando se inserta un fragmento de ADN extraño en un plásmido ). Los extremos de los fragmentos de ADN se unen mediante la formación de enlaces fosfodiéster entre el 3'-hidroxilo de un extremo del ADN con el 5'-fosforilo de otro. El ARN también puede ligarse de manera similar. Generalmente interviene un cofactor en la reacción, que suele ser ATP o NAD + . Las ligasas de las células eucariotas pertenecen al tipo ATP y las dependientes de NAD+ se encuentran en las bacterias (p. ej., E. coli ). [1]

El descubrimiento de la ADN ligasa se remonta a 1967 y es un acontecimiento importante en el campo de la biología molecular . [1] La ligadura en el laboratorio normalmente se realiza utilizando ADN ligasa T4 . Se utiliza ampliamente in vitro como herramienta de investigación en biología molecular debido a su capacidad para unir extremos de ADN tan pegajosos como romos. [2] Sin embargo, los procedimientos de ligadura sin el uso de ADN ligasa estándar también son populares. Las anomalías de las ligasas del ADN humano se han relacionado con trastornos patológicos caracterizados por inmunodeficiencia, sensibilidad a la radiación y problemas de desarrollo. [3]

Reacción de ligadura

El mecanismo de la reacción de ligadura fue aclarado por primera vez en el laboratorio de I. Robert Lehman. [4] [5] Se pueden unir dos fragmentos de ADN mediante la ADN ligasa , que cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre el grupo 3'-hidroxilo (-OH) en un extremo de una cadena de ADN y el grupo 5'-fosfato. (-PO4) de otro. En animales y bacteriófagos se utiliza ATP como fuente de energía para la ligadura, mientras que en bacterias se utiliza NAD + . [6]

La ADN ligasa reacciona primero con ATP o NAD + , formando un intermedio ligasa-AMP con el AMP unido al grupo ε-amino de la lisina en el sitio activo de la ligasa mediante un enlace fosforamida. Este grupo adenililo luego se transfiere al grupo fosfato en el extremo 5' de una cadena de ADN, formando un complejo ADN-adenilato. Finalmente, se forma un enlace fosfodiéster entre los dos extremos del ADN mediante el ataque nucleofílico del 3'-hidroxilo del extremo de una cadena de ADN sobre el grupo 5'-fosforilo activado de otra. [4]

La ligasa puede reparar muy eficazmente una mella en el ADN (es decir, una rotura en una hebra de un ADN bicatenario). Sin embargo, se presenta una característica complicada de la ligadura cuando se ligan dos extremos de ADN separados, ya que los dos extremos deben unirse antes de que pueda continuar la reacción de ligación. En la ligadura de ADN con extremos pegajosos o cohesivos , las hebras de ADN que sobresalen pueden ya estar hibridadas, por lo que es un proceso relativamente eficiente ya que equivale a reparar dos mellas en el ADN. Sin embargo, en la ligadura de extremos romos , que carecen de extremos sobresalientes para que el ADN se hibride, el proceso depende de una colisión aleatoria para que los extremos se alineen antes de que puedan ligarse y, en consecuencia, es un proceso mucho menos eficiente. [7] La ​​ADN ligasa de E. coli no puede ligar ADN con extremos romos excepto en condiciones de hacinamiento molecular y, por lo tanto, normalmente no se utiliza para la ligación en el laboratorio. En su lugar, se utiliza la ADN ligasa del fago T4, ya que puede ligar ADN con extremos romos y ADN monocatenario. [8] [6]

Factores que afectan la ligadura.

Los factores que afectan una reacción química mediada por enzimas afectarían naturalmente una reacción de ligación, como la concentración de enzima y los reactivos, así como la temperatura de reacción y el tiempo de incubación. La ligadura se complica por el hecho de que los productos de ligadura deseados para la mayoría de las reacciones de ligadura deben estar entre dos moléculas de ADN diferentes y la reacción implica reacciones tanto intermoleculares como intramoleculares, y que es necesario un paso de hibridación adicional para una ligadura eficaz.

Los tres pasos para formar un nuevo enlace fosfodiéster durante la ligadura son: adenililación enzimática, transferencia de adenililo al ADN y sellado de mella. El Mg(2+) es un cofactor para la catálisis, por lo tanto, a altas concentraciones de Mg(2+), la eficiencia de la ligación es alta. Si la concentración de Mg(2+) es limitada, el sellado de mella es la reacción limitante de la velocidad del proceso y el intermediario de ADN adenililado permanece en la solución. Tal adenililación de la enzima restringe la reunión al ADN adenililado intermedio en comparación con un talón de Aquiles de LIG1, y representa un riesgo si no se fijan. [9]

concentración de ADN

La concentración de ADN puede afectar la velocidad de ligación y si la ligación es una reacción intermolecular o intramolecular. La ligadura implica unir los extremos de un ADN con otros extremos; sin embargo, cada fragmento de ADN tiene dos extremos y, si los extremos son compatibles, una molécula de ADN puede circular uniendo sus propios extremos. A una concentración alta de ADN, existe una mayor probabilidad de que un extremo de una molécula de ADN se encuentre con el extremo de otro ADN, formando así una ligadura intermolecular. A una concentración de ADN más baja, aumenta la posibilidad de que un extremo de una molécula de ADN se encuentre con el otro extremo de la misma molécula, por lo que es más probable que se produzca una reacción intramolecular que circule el ADN. La eficiencia de transformación del ADN lineal también es mucho menor que la del ADN circular, y para que el ADN se circularice, la concentración de ADN no debe ser demasiado alta. Como regla general, la concentración total de ADN debe ser inferior a 10 μg/ml. [10]

La concentración relativa de los fragmentos de ADN, su longitud y las condiciones del tampón también son factores que pueden afectar si se favorecen las reacciones intermoleculares o intramoleculares.

La concentración de ADN se puede aumentar artificialmente añadiendo agentes de condensación como la hexamina de cobalto y poliaminas biogénicas como la espermidina , o utilizando agentes de aglomeración como el polietilenglicol (PEG), que también aumentan la concentración eficaz de enzimas. [11] [12] Sin embargo, tenga en cuenta que los aditivos como la hexamina de cobalto pueden producir reacciones exclusivamente intermoleculares, [11] dando como resultado concatémeros lineales en lugar del ADN circular, más adecuado para la transformación del ADN plasmídico y, por lo tanto, no es deseable para la ligación de plásmidos. Si es necesario utilizar aditivos en la ligadura de plásmidos, es preferible el uso de PEG, ya que puede promover la ligadura tanto intramolecular como intermolecular. [13]

Concentración de ligasa

Cuanto mayor sea la concentración de ligasa, más rápida será la velocidad de ligadura. La ligadura de extremos romos es mucho menos eficiente que la ligadura de extremos adhesivos, por lo que se utiliza una mayor concentración de ligasa en las ligaduras de extremos romos. Se puede usar una concentración alta de ADN ligasa junto con PEG para una ligadura más rápida, y son los componentes que a menudo se encuentran en kits comerciales diseñados para una ligadura rápida. [14] [15]

Temperatura

Hay dos cuestiones involucradas al considerar la temperatura de una reacción de ligadura. Primero, la temperatura óptima para la actividad de la ADN ligasa que es 37 ° C, y segundo, la temperatura de fusión (Tm ) del ADN que termina a ligarse. La temperatura de fusión depende de la longitud y la composición de bases del ADN saliente: cuanto mayor es el número de G y C, mayor es la Tm, ya que se forman tres enlaces de hidrógeno entre el par de bases GC en comparación con dos para el par de bases AT, con algunos contribución del apilamiento de las bases entre fragmentos. Para que la reacción de ligación se desarrolle de manera eficiente, los extremos deben estar recocidos de manera estable y, en los experimentos de ligación, la Tm de los extremos del ADN es generalmente mucho menor que 37 ° C. La temperatura óptima para ligar extremos cohesivos es, por lo tanto, un compromiso entre las mejores temperatura para la actividad de la ADN ligasa y la Tm donde se pueden asociar los extremos. [16] Sin embargo, diferentes enzimas de restricción generan diferentes extremos, y la composición base de los extremos producidos por estas enzimas también puede diferir, la temperatura de fusión y por lo tanto la temperatura óptima pueden variar ampliamente dependiendo de las enzimas de restricción utilizadas, y la temperatura óptima para La ligadura puede estar entre 4-15 ° C dependiendo de los extremos. [17] [18] Las ligaciones también implican a menudo ligar extremos generados a partir de diferentes enzimas de restricción en la misma mezcla de reacción, por lo tanto, puede no ser práctico seleccionar la temperatura óptima para una reacción de ligación particular y la mayoría de los protocolos simplemente eligen 12-16 ° C, temperatura ambiente. temperatura, o 4 ° C.

Composición del tampón

La fuerza iónica del tampón utilizado puede afectar la ligadura. Los tipos de presencia de cationes también pueden influir en la reacción de ligación; por ejemplo, una cantidad excesiva de Na + puede hacer que el ADN se vuelva más rígido y aumentar la probabilidad de ligadura intermolecular. A una concentración elevada de catión monovalente (>200 mM), la ligación también puede inhibirse casi por completo. [19] El tampón estándar utilizado para la ligadura está diseñado para minimizar los efectos iónicos. [20]

Ligadura con extremos adhesivos

Las enzimas de restricción pueden generar una amplia variedad de extremos en el ADN que digieren, pero en experimentos de clonación las enzimas de restricción más comúnmente utilizadas generan un saliente monocatenario de 4 bases llamado extremo pegajoso o cohesivo (las excepciones incluyen Nde I , que genera un extremo 2-). voladizo de base, y aquellos que generan extremos romos). Estos extremos adhesivos pueden recocerse con otros extremos compatibles y ligarse en una ligadura de extremos adhesivos (o extremos cohesivos). Eco RI, por ejemplo, genera un extremo AATT, y dado que A y T tienen una temperatura de fusión más baja que C y G, su temperatura de fusión T m es baja, alrededor de 6 ° C. [21] Para la mayoría de las enzimas de restricción, los salientes generados tienen una T m es decir alrededor de 15 ° C. [20] Para fines prácticos, las ligaduras de extremos adhesivos se realizan a 12-16 ° C, o a temperatura ambiente, o alternativamente a 4 ° C durante un período más largo.

Para la inserción de un fragmento de ADN en un vector plasmídico, es preferible utilizar dos enzimas de restricción diferentes para digerir el ADN de modo que se generen extremos diferentes. Los dos extremos diferentes pueden evitar la religación del vector sin ningún inserto y también permiten que el fragmento se inserte de manera direccional.

Cuando no es posible utilizar dos sitios diferentes, es posible que sea necesario desfosforilar el ADN del vector para evitar un fondo elevado de ADN del vector recircularizado sin inserto. Sin un grupo fosfato en los extremos, el vector no puede ligarse a sí mismo, pero puede ligarse a un inserto con un grupo fosfato. La desfosforilación se realiza comúnmente usando fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIAP), que elimina el grupo fosfato del extremo 5' del ADN digerido, pero tenga en cuenta que la CIAP no es fácil de inactivar y puede interferir con la ligadura sin un paso adicional para eliminar la CIAP. resultando así en el fracaso de la ligadura. CIAP no debe usarse en cantidades excesivas y solo debe usarse cuando sea necesario. La fosfatasa alcalina de camarón (SAP) o la fosfatasa antártica (AP) son alternativas adecuadas ya que pueden inactivarse fácilmente.

Ligadura de extremo romo

La ligadura de extremos romos no implica el emparejamiento de bases de los extremos que sobresalen, por lo que cualquier extremo romo puede ligarse a otro extremo romo. Los extremos romos pueden generarse mediante enzimas de restricción como SmaI y Eco RV . Una ventaja importante de la clonación de extremos romos es que el inserto deseado no requiere ningún sitio de restricción en su secuencia, ya que los extremos romos generalmente se generan en una PCR , y el fragmento de ADN de extremos romos generado por la PCR puede luego ligarse en un fragmento de ADN de extremos romos. vector terminado generado a partir del resumen de restricción.

Sin embargo, la ligadura con extremos romos es mucho menos eficiente que la ligadura con extremos adhesivos; normalmente la reacción es 100 veces más lenta que la ligadura con extremos adhesivos. Dado que el extremo romo no tiene extremos sobresalientes, la reacción de ligadura depende de colisiones aleatorias entre los extremos romos y, en consecuencia, es mucho menos eficiente. Para compensar la menor eficiencia, la concentración de ligasa utilizada es mayor que la ligadura de extremos adhesivos (10 veces o más). La concentración de ADN utilizada en la ligadura de extremos romos también es mayor para aumentar la probabilidad de colisiones entre los extremos, y también se puede utilizar un tiempo de incubación más prolongado para las ligaduras de extremos romos.

Si ambos extremos que se deben ligar en un vector son romos, entonces el vector debe desfosforilarse para minimizar la autoligación. Esto se puede hacer usando CIAP, pero es necesario tener precaución en su uso, como se señaló anteriormente. Dado que el vector ha sido desfosforilado y la ligación requiere la presencia de un 5'-fosfato, el inserto debe estar fosforilado. El producto de PCR de extremos romos normalmente carece de 5'-fosfato, por lo que debe fosforilarse mediante tratamiento con polinucleótido quinasa T4 . [22]

La ligadura de extremos romos también se inhibe reversiblemente por una alta concentración de ATP. [23]

La PCR generalmente genera productos de PCR con extremos romos, pero tenga en cuenta que la PCR que utiliza la polimerasa Taq puede agregar una adenina adicional (A) al extremo 3' del producto de PCR. Esta propiedad puede explotarse en la clonación TA donde los extremos del producto de PCR pueden aparearse con el extremo T de un vector. Por lo tanto, la ligadura TA es una forma de ligadura de extremos adhesivos. Los vectores de extremos romos se pueden convertir en vectores para la ligación de TA con trifosfato de didesoxitimidina (ddTTP) usando transferasa terminal.

Reglas generales

Para la clonación de un inserto en un plásmido circular:

Solución de problemas

A veces, la ligadura no produce los productos ligados deseados y algunas de las posibles razones pueden ser:

Otros métodos de ligadura de ADN.

Varios kits de clonación de ADN disponibles comercialmente utilizan otros métodos de ligación que no requieren el uso de las ADN ligasas habituales. Estos métodos permiten que la clonación se realice mucho más rápidamente, además de permitir una transferencia más sencilla del inserto de ADN clonado a diferentes vectores . Sin embargo, estos métodos requieren el uso de vectores y componentes especialmente diseñados y pueden carecer de flexibilidad.

Ligadura mediada por topoisomerasa

Se puede utilizar topoisomerasa en lugar de ligasa para la ligación, y la clonación se puede realizar más rápidamente sin necesidad de digestión de restricción del vector o inserto. En este método de clonación TOPO, se activa un vector linealizado uniendo la topoisomerasa I a sus extremos, y este vector "activado por TOPO" puede luego aceptar un producto de PCR ligando a ambos extremos 5' del producto de PCR, se libera la topoisomerasa. y en el proceso se forma un vector circular. [28]

Recombinación homóloga

Otro método de clonación sin el uso de ligasa es mediante recombinación de ADN , por ejemplo como se usa en el sistema de clonación Gateway . [29] [30] El gen, una vez clonado en el vector de clonación (llamado clon de entrada en este método), puede introducirse convenientemente en una variedad de vectores de expresión mediante recombinación. [31]

Ejemplos y aplicaciones de ADN ligasas.

Diferentes tipos de ligasas encontradas en los organismos estudiados. Por ejemplo, la ligasa dependiente de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) se encontró y aisló de un organismo bacteriano conocido como E. coli en el segundo tercio del siglo XX. Desde entonces, este modelo se ha utilizado ampliamente para estudiar esa familia de ADN ligasas. Además, se encuentra en todas las bacterias. Ejemplos de genes presentes en E. coli son LigA, que tiene funciones esenciales que afectan el crecimiento bacteriano, y LigB. [32]

En los mamíferos, incluido el ser humano, se identificaron 3 genes: Lig1, Lig3 y Lig4. Todos los eucariotas contienen múltiples tipos de ADN ligasas codificadas por genes Lig. [33] La ligasa eucariota más pequeña conocida es la ADN ligasa del virus Chlorella (ChVLig). Contiene sólo 298 aminoácidos. Cuando ChVLig es la única fuente de ligasa en la célula, puede continuar apoyando el desarrollo mitótico y la unión de extremos no homólogos en levaduras en ciernes. [34] Se están estudiando las anomalías en la regulación de la familia de ubiquitina ligasas E3 y, como algunas otras ligasas, están asociadas con cánceres, enfermedades autoinmunes y otros trastornos. [35] [36] Las ubiquitina ligasas E3, como Hdm2, pueden estudiarse, caracterizarse y utilizarse más a fondo como biomarcadores de cáncer prácticos porque se sobreexpresan en varios tipos de cáncer en humanos que tienen un pronóstico negativo en términos de supervivencia de los pacientes. [37] [38] La ADN ligasa I (Lig1) es responsable de la ligadura de los fragmentos de Okazaki. Se compone de 919 aminoácidos. En un complejo proceso de replicación del ADN, la ADN Ligasa I se reclutó en la maquinaria de replicación mediante interacciones de proteínas. Lig1 desempeña un papel en la división celular en plantas y levaduras. La desactivación del gen Lig1 es letal en levaduras y algunos brotes de plantas. Sin embargo, los estudios de embriogénesis en ratones han demostrado que hasta la mitad del proceso de crecimiento el embrión se desarrolla sin ADN ligasa I. [39]

La ligadura enzimática se ha utilizado en varios estudios relacionados con las nanoestructuras del ADN y conduce a un aumento de la eficiencia y la estabilidad. Uno de los métodos es el sellado del enlace covalente del ADN, es decir, el enlace fosfodiéster y las mellas. Reconstrucción de aquellas estructuras realizada con asistencia de ligadura. Por ejemplo, la ADN ligasa T4 sirve como catalizador para sellar una muesca entre los extremos 3 y 5 del ADN para formar un fuerte enlace fosfodiéster. Las estructuras ligadas tienen valores de estabilidad térmica más altos. [40] La ADN ligasa T4 tiene muchas propiedades valiosas, como la catalítica ya mencionada, pero también es responsable del sellado de los espacios entre las cadenas de ADN, la actividad de cierre de mellas, la reparación del daño del ADN, etc. [2]

En la arquitectura de nanoestructuras, las investigaciones de biología molecular: el ssDNA es un modelo de aplicación importante. La ADN ligasa T4 se utiliza para ciclar fragmentos cortos de ADN ss, pero el proceso se complica por la formación de estructuras secundarias. Por otro lado, la Taq ADN ligasa es una enzima termoestable que se puede aplicar a temperaturas más altas (45, 55 y 65 °C respectivamente). Dado que en este rango de temperaturas las estructuras secundarias son menos estables, se mejora la eficiencia de ciclación de los oligonucleótidos. Los parámetros cinéticos, biológicos y otros de las nanoestructuras están influenciados por la presencia de estructuras secundarias en los anillos de ADN. Sin embargo, la ligadura del ADN Taq ocurre sólo cuando dos cadenas de ADN complementarias están perfectamente emparejadas y no tienen espacios entre ellas. [41]

Análisis de actividades, mutaciones y deficiencias de ligasas ampliamente utilizadas en el diseño de fármacos y en investigaciones biológicas para investigar enfermedades, desarrollos de patologías y síndromes raros adquiridos o heredados relacionados (por ejemplo, síndrome de ADN ligasa IV). [42] [43] [44] [45]

El procedimiento de ligación prevalece en las técnicas de clonación de biología molecular y se ha aplicado para definir y caracterizar secuencias de nucleótidos específicas en el genoma mediante la amplificación de sondas ligadas basada en la reacción en cadena de la ligasa (LCR) o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). [46]

Análisis

La ligadura también puede servir como método de análisis de ADN . [47] Algunas técnicas emplean amplificación de círculo rodante . [47] El más notable de ellos es el descrito por Smolina et al. , 2007 y Smolina et al. , 2008 utilizando hibridación fluorescente in situ y ácidos peptídicos nucleicos . [47] Desarrollaron y emplearon esta técnica para análisis de cromosomas bacterianos. [47]

Ver también

Referencias

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