La ADN ligasa es un tipo de enzima que facilita la unión de cadenas de ADN al catalizar la formación de un enlace fosfodiéster . Desempeña un papel en la reparación de roturas de una sola hebra en el ADN dúplex en organismos vivos, pero algunas formas (como la ADN ligasa IV ) pueden reparar específicamente roturas de doble hebra (es decir, una rotura en ambas hebras complementarias de ADN). Las roturas de una sola hebra son reparadas por la ADN ligasa utilizando la hebra complementaria de la doble hélice como plantilla, [1] y la ADN ligasa crea el enlace fosfodiéster final para reparar completamente el ADN.
La ADN ligasa se utiliza tanto en la reparación como en la replicación del ADN (ver Ligasas de mamíferos ). Además, la ADN ligasa tiene un amplio uso en laboratorios de biología molecular para experimentos de ADN recombinante (ver Aplicaciones de investigación ). La ADN ligasa purificada se utiliza en la clonación de genes para unir moléculas de ADN para formar ADN recombinante .
El mecanismo de la ADN ligasa consiste en formar dos enlaces fosfodiéster covalentes entre los extremos 3' hidroxilo de un nucleótido ("aceptor") y el extremo 5' fosfato de otro ("donante"). Por cada enlace fosfodiéster formado se consumen dos moléculas de ATP. [ cita necesaria ] Se requiere AMP para la reacción de la ligasa, que se desarrolla en cuatro pasos:
La ligasa también funcionará con extremos romos , aunque se requieren concentraciones de enzima más altas y diferentes condiciones de reacción.
La ADN ligasa de E. coli está codificada por el gen lig . La ADN ligasa en E. coli , así como en la mayoría de los procariotas, utiliza la energía obtenida al escindir el dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD) para crear el enlace fosfodiéster. [3] No liga ADN de extremos romos excepto en condiciones de hacinamiento molecular con polietilenglicol , y no puede unir el ARN al ADN de manera eficiente. [ cita necesaria ]
La actividad de la ADN ligasa de E. coli puede mejorarse mediante la ADN polimerasa en las concentraciones adecuadas. La mejora sólo funciona cuando las concentraciones de ADN polimerasa 1 son mucho más bajas que los fragmentos de ADN que se van a ligar. Cuando las concentraciones de ADN polimerasas Pol I son más altas, tiene un efecto adverso sobre la ADN ligasa de E. coli [4]
La ADN ligasa del bacteriófago T4 (un bacteriófago que infecta la bacteria Escherichia coli ). La ligasa T4 es la más utilizada en investigaciones de laboratorio. [5] Puede ligar extremos cohesivos o romos de ADN, oligonucleótidos, así como ARN e híbridos de ARN-ADN, pero no ácidos nucleicos monocatenarios. También puede ligar ADN de extremos romos con mucha mayor eficacia que la ADN ligasa de E. coli . A diferencia de la ADN ligasa de E. coli , la ADN ligasa T4 no puede utilizar NAD y tiene un requerimiento absoluto de ATP como cofactor. Se han realizado algunos trabajos de ingeniería para mejorar la actividad in vitro de la ADN ligasa T4; un enfoque exitoso, por ejemplo, probó la ADN ligasa T4 fusionada con varias proteínas de unión al ADN alternativas y descubrió que las construcciones con p50 o NF-kB como compañeros de fusión eran más de un 160% más activas en ligaduras de extremos romos con fines de clonación que las de tipo salvaje. ADN ligasa T4. [6] Una reacción típica para insertar un fragmento en un vector plasmídico utilizaría aproximadamente 0,01 (extremos pegajosos) a 1 (extremos romos) unidades de ligasa. La temperatura de incubación óptima para la ADN ligasa T4 es de 16 °C. [ cita necesaria ]
Los mutantes de la ligasa T4 del bacteriófago tienen una mayor sensibilidad tanto a la irradiación UV [7] [8] como al agente alquilante metanosulfonato de metilo [9], lo que indica que la ADN ligasa se emplea en la reparación de los daños en el ADN causados por estos agentes.
En los mamíferos, existen cuatro tipos específicos de ligasa.
La ADN ligasa de eucariotas y algunos microbios utiliza trifosfato de adenosina (ATP) en lugar de NAD. [3]
Derivada de una bacteria termófila, la enzima es estable y activa a temperaturas mucho más altas que las ADN ligasas convencionales. Su vida media es de 48 horas a 65 °C y superior a 1 hora a 95 °C. Se ha demostrado que la ADN ligasa ampligasa está activa durante al menos 500 ciclos térmicos (94 °C/80 °C) o 16 horas de ciclo. 10 Esta termoestabilidad excepcional permite una rigurosidad de hibridación y una especificidad de ligación extremadamente altas. [11]
Hay al menos tres unidades diferentes que se utilizan para medir la actividad de la ADN ligasa: [12]
Las ADN ligasas se han convertido en herramientas indispensables en la investigación moderna de biología molecular para generar secuencias de ADN recombinante . Por ejemplo, las ADN ligasas se utilizan con enzimas de restricción para insertar fragmentos de ADN, a menudo genes , en plásmidos .
Controlar la temperatura óptima es un aspecto vital para realizar experimentos de recombinación eficientes que impliquen la ligadura de fragmentos con extremos cohesivos. La mayoría de los experimentos utilizan ADN ligasa T4 (aislada del bacteriófago T4 ), que es más activa a 37 °C. [13] Sin embargo, para una eficiencia de ligación óptima con fragmentos con extremos cohesivos ("extremos pegajosos"), la temperatura óptima de la enzima debe equilibrarse con la temperatura de fusión T m de los extremos pegajosos que se ligan, [14] el emparejamiento homólogo de los Los extremos pegajosos no serán estables porque la alta temperatura interrumpe los enlaces de hidrógeno . Una reacción de ligadura es más eficaz cuando los extremos adhesivos ya están recocidos de forma estable y, por lo tanto, la alteración de los extremos de recocido daría como resultado una baja eficacia de ligadura. Cuanto más corto sea el voladizo , menor será la Tm .
Dado que los fragmentos de ADN con extremos romos no tienen extremos cohesivos para templar, la temperatura de fusión no es un factor a considerar dentro del rango de temperatura normal de la reacción de ligación. El factor limitante en la ligadura de extremos romos no es la actividad de la ligasa sino el número de alineaciones entre los extremos de los fragmentos de ADN que se producen. Por lo tanto, la temperatura de ligadura más eficiente para el ADN con extremos romos sería la temperatura a la que puede ocurrir el mayor número de alineamientos. La mayoría de las ligaduras de extremos romos se llevan a cabo a 14-25 °C durante la noche. La ausencia de extremos recocidos de forma estable también significa que la eficacia de la ligadura se reduce, lo que requiere el uso de una concentración de ligasa más alta. [14]
Se puede observar un uso novedoso de la ADN ligasa en el campo de la nanoquímica, específicamente en el origami de ADN. Los principios de autoensamblaje basados en el ADN han demostrado ser útiles para organizar objetos a nanoescala, como biomoléculas, nanomáquinas y componentes nanoelectrónicos y fotónicos. El ensamblaje de dicha nanoestructura requiere la creación de una intrincada malla de moléculas de ADN. Aunque el autoensamblaje del ADN es posible sin ayuda externa utilizando diferentes sustratos, como la provisión de una superficie catatónica de papel de aluminio, la ADN ligasa puede proporcionar la asistencia enzimática necesaria para crear una estructura reticular de ADN a partir de ADN colgado. [15]
La primera ADN ligasa fue purificada y caracterizada en 1967 por los laboratorios Gellert, Lehman, Richardson y Hurwitz. [16] Weiss y Richardson lo purificaron y caracterizaron por primera vez mediante un proceso de fraccionamiento cromatográfico de seis pasos que comenzó con la eliminación de restos celulares y la adición de estreptomicina, seguido de varios lavados de columna de dietilaminoetil (DEAE)-celulosa y un fraccionamiento final de fosfocelulosa. El extracto final contenía el 10% de la actividad registrada inicialmente en el medio de E. coli ; A lo largo del proceso se descubrió que ATP y Mg++ eran necesarios para optimizar la reacción. Las ADN ligasas comunes disponibles comercialmente se descubrieron originalmente en el bacteriófago T4 , E. coli y otras bacterias . [17]
Las deficiencias genéticas en las ADN ligasas humanas se han asociado con síndromes clínicos marcados por inmunodeficiencia, sensibilidad a la radiación y anomalías del desarrollo. [16] El síndrome LIG4 (síndrome de la Ligasa IV) es una enfermedad rara asociada con mutaciones en la ADN ligasa 4 e interfiere con la rotura del ADN ds. mecanismos de reparación. El síndrome de ligasa IV causa inmunodeficiencia en individuos y comúnmente se asocia con microcefalia e hipoplasia de la médula ósea. [18] A continuación se incluye una lista de enfermedades prevalentes causadas por la falta o el mal funcionamiento de la ADN ligasa.
El xeroderma pigmentoso, comúnmente conocido como XP, es una afección hereditaria caracterizada por una sensibilidad extrema a los rayos ultravioleta (UV) de la luz solar. Esta afección afecta principalmente a los ojos y las zonas de piel expuestas al sol. Algunas personas afectadas también tienen problemas que afectan al sistema nervioso. [19]
Las mutaciones en el gen ATM causan ataxia-telangiectasia . El gen ATM proporciona instrucciones para producir una proteína que ayuda a controlar la división celular y participa en la reparación del ADN. Esta proteína juega un papel importante en el desarrollo y la actividad normal de varios sistemas del cuerpo, incluidos el sistema nervioso y el sistema inmunológico. La proteína ATM ayuda a las células a reconocer las hebras de ADN dañadas o rotas y coordina la reparación del ADN activando enzimas que reparan las hebras rotas. La reparación eficiente de las cadenas de ADN dañadas ayuda a mantener la estabilidad de la información genética de la célula. Los niños afectados suelen desarrollar dificultad para caminar, problemas de equilibrio y coordinación de las manos, movimientos espasmódicos involuntarios (corea), espasmos musculares (mioclono) y alteraciones en la función nerviosa (neuropatía). Los problemas de movimiento suelen hacer que las personas necesiten asistencia en silla de ruedas en la adolescencia. Las personas con este trastorno también tienen dificultad para hablar y dificultad para mover los ojos para mirar de lado a lado (apraxia oculomotora). [20]
La anemia de Fanconi (AF) es un trastorno sanguíneo hereditario poco común que provoca insuficiencia de la médula ósea. La FA impide que la médula ósea produzca suficientes células sanguíneas nuevas para que el cuerpo funcione normalmente. La FA también puede hacer que la médula ósea produzca muchas células sanguíneas defectuosas. Esto puede provocar problemas de salud graves, como la leucemia . [21]
El síndrome de Bloom provoca una piel sensible a la exposición al sol y, por lo general, el desarrollo de una mancha de piel enrojecida en forma de mariposa en la nariz y las mejillas. Una erupción cutánea también puede aparecer en otras áreas que normalmente están expuestas al sol, como el dorso de las manos y los antebrazos. A menudo aparecen pequeños grupos de vasos sanguíneos agrandados (telangiectasias) en la erupción; Las telangiectasias también pueden ocurrir en los ojos. Otras características de la piel incluyen parches de piel que son más claros o más oscuros que las áreas circundantes (hipopigmentación o hiperpigmentación, respectivamente). Estas manchas aparecen en zonas de la piel que no están expuestas al sol y su desarrollo no está relacionado con las erupciones.
En estudios recientes, la ADN ligasa I humana se utilizó en el diseño de fármacos asistido por computadora para identificar inhibidores de la ADN ligasa como posibles agentes terapéuticos para tratar el cáncer. [22] Dado que el crecimiento celular excesivo es un sello distintivo del desarrollo del cáncer, la quimioterapia dirigida que altera el funcionamiento de la ADN ligasa puede impedir las formas de cáncer adyuvante. Además, se ha demostrado que las ADN ligasas se pueden dividir ampliamente en dos categorías, a saber, dependientes de ATP y NAD + . Investigaciones anteriores han demostrado que, aunque se han descubierto ADN ligasas dependientes de NAD + en nichos celulares o virales esporádicos fuera del dominio de la vida bacteriana, no hay ningún caso en el que una ligasa dependiente de NAD + esté presente en un organismo eucariota . La presencia únicamente en organismos no eucariotas, la especificidad de sustrato única y la estructura de dominio distintiva de las ligasas de ADN humanas dependientes de NAD+ en comparación con las dependientes de ATP hacen que las ligasas dependientes de NAD + sean objetivos ideales para el desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos. [dieciséis]
