Los extremos del ADN se refieren a las propiedades de los extremos de las moléculas de ADN lineal , que en biología molecular se describen como "pegajosos" o "romos" según la forma de las hebras complementarias en el extremo. En los extremos pegajosos , una hebra es más larga que la otra (normalmente por al menos unos pocos nucleótidos), de modo que la hebra más larga tiene bases que quedan sin aparear. En los extremos romos , ambas hebras tienen la misma longitud, es decir, terminan en la misma posición de base, sin dejar bases sin aparear en ninguna de las hebras.
El concepto se utiliza en biología molecular , en clonación o cuando se subclona ADN insertado en ADN vector . Dichos extremos pueden generarse mediante enzimas de restricción que rompen la cadena principal de fosfodiéster de la molécula en lugares específicos, que a su vez pertenecen a una clase más grande de enzimas llamadas exonucleasas y endonucleasas . Una enzima de restricción que corta las cadenas principales de ambas hebras en lugares no adyacentes deja un corte escalonado, generando dos extremos pegajosos superpuestos, mientras que una enzima que hace un corte recto (en lugares directamente uno frente al otro en ambas hebras) genera dos extremos romos. [1]
Una molécula de ADN monocatenario no circular tiene dos extremos no idénticos, el extremo 3' y el extremo 5' (que normalmente se pronuncian "three prime end" y "five prime end"). Los números hacen referencia a la numeración de los átomos de carbono en la desoxirribosa , que es un azúcar que forma una parte importante de la estructura principal de la molécula de ADN. En la estructura principal del ADN, el carbono 5' de una desoxirribosa está unido al carbono 3' de otra mediante un enlace fosfodiéster. [2]
Cuando una molécula de ADN es bicatenaria, como suele ser el caso del ADN, las dos hebras discurren en direcciones opuestas. Por lo tanto, un extremo de la molécula tendrá el extremo 3' de la hebra 1 y el extremo 5' de la hebra 2, y viceversa en el otro extremo. [2] Sin embargo, el hecho de que la molécula sea bicatenaria permite numerosas variaciones diferentes.
El extremo más simple de ADN de una molécula de doble cadena se llama extremo romo . Los extremos romos también se conocen como extremos no cohesivos. En una molécula con extremos romos, ambas cadenas terminan en un par de bases . Los extremos romos no siempre son deseados en biotecnología ya que cuando se utiliza una ADN ligasa para unir dos moléculas en una, el rendimiento es significativamente menor con extremos romos. [3] Al realizar la subclonación, también tiene la desventaja de insertar potencialmente el ADN de inserción en la orientación opuesta deseada. Por otro lado, los extremos romos siempre son compatibles entre sí. Aquí hay un ejemplo de un pequeño trozo de ADN con extremos romos:
5'- GATCTGACTGATGCGTATGCTAGT -3'3'- CTAGACTGACTACGCATACGATCA -5'
Los extremos no romos se crean mediante diversos salientes . Un saliente es un tramo de nucleótidos no apareados en el extremo de una molécula de ADN. Estos nucleótidos no apareados pueden estar en cualquiera de las cadenas, lo que crea salientes de 3' o 5'. [3] En la mayoría de los casos, estos salientes son palindrómicos.
El caso más simple de un saliente es un único nucleótido. Este suele ser adenina y algunas polimerasas de ADN lo crean como un saliente 3' . Esto se utiliza más comúnmente en productos de PCR de clonación creados por una enzima de este tipo. El producto se une con una molécula de ADN lineal con un saliente 3' de timina . Dado que la adenina y la timina forman un par de bases , esto facilita la unión de las dos moléculas por una ligasa, lo que produce una molécula circular. Aquí hay un ejemplo de un saliente A:
5'- ATCTGACTA -3'3'- TAGACTGA -5'
Los extremos salientes más largos se denominan extremos cohesivos o extremos pegajosos . [3] La mayoría de las veces, las endonucleasas de restricción los crean cuando cortan el ADN. Muy a menudo, cortan las dos cadenas de ADN separadas por cuatro pares de bases, lo que crea un saliente 3' de cuatro bases en una molécula y un saliente 3' complementario en la otra. Estos extremos se denominan cohesivos porque una ligasa los vuelve a unir fácilmente.
Por ejemplo, estos dos extremos "pegajosos" (salientes de 5' de cuatro bases) son compatibles:
5'- ATCTGACT GATGCGTATGCT -3'3'- TAGACTGACTACG CATACGA -5'
Además, dado que las diferentes endonucleasas de restricción suelen crear diferentes salientes, es posible crear un plásmido cortando un fragmento de ADN (utilizando una enzima diferente para cada extremo) y uniéndolo a otra molécula de ADN con extremos recortados por las mismas enzimas. Dado que los salientes tienen que ser complementarios para que la ligasa funcione, las dos moléculas solo pueden unirse en una orientación. Esto suele ser muy deseable en biología molecular .
Los extremos pegajosos se pueden convertir en extremos romos mediante un proceso conocido como embotamiento, que implica rellenar el extremo pegajoso con nucleótidos complementarios. Esto produce un extremo romo, sin embargo, los extremos pegajosos suelen ser preferibles, lo que significa que el uso principal de este método es marcar el ADN utilizando nucleótidos radiomarcados para rellenar el hueco. [4] Los extremos romos también se pueden convertir en extremos pegajosos mediante la adición de secuencias de enlace de doble cadena que contienen secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción que crean extremos pegajosos y la posterior aplicación de la enzima de restricción o mediante la aplicación de colas de homopolímero, que se refiere a la extensión de los extremos 3' de la molécula con un solo nucleótido, lo que permite un emparejamiento específico con el nucleótido correspondiente (por ejemplo, poli-C con poli-G). [3]
Frente a cada hebra de ADN, normalmente vemos un par de adenina con timina y un par de citosina con guanina para formar una hebra complementaria paralela, como se describe a continuación. Dos secuencias de nucleótidos que se corresponden entre sí de esta manera se denominan complementarias:
5'- ATCTGACT -3'3'- TAGACTGA -5'
Un extremo deshilachado se refiere a una región de una molécula de ADN bicatenario (o multicatenario) cerca del extremo con una proporción significativa de secuencias no complementarias; es decir, una secuencia donde los nucleótidos en las cadenas adyacentes no coinciden correctamente:
5'- ATCTGACTAGGCA -3'3'- TAGACTGA CTACG -5'
Se utiliza el término "deshilachado" porque los nucleótidos que no coinciden correctamente tienden a evitar la unión, por lo que parecen similares a las hebras de un trozo de cuerda deshilachada.
Aunque también son posibles secuencias no complementarias en medio del ADN bicatenario, las regiones desparejas alejadas de los extremos no se denominan "deshilachadas".
Ronald W. Davis fue el primero en descubrir los extremos pegajosos como producto de la acción de EcoRI , la endonucleasa de restricción . [5]
Los enlaces de extremos pegajosos difieren en su estabilidad. Se puede medir la energía libre de formación para estimar la estabilidad. Se pueden hacer aproximaciones de energía libre para diferentes secuencias a partir de datos relacionados con las curvas de desnaturalización térmica UV de oligonucleótidos. [6] Además, las predicciones de las simulaciones de dinámica molecular muestran que algunos enlaces de extremos pegajosos son mucho más fuertes en el estiramiento que otros. [7]
produce un extremo cohesivo (P4914) (ver usos )