Los vectores lentivirales en terapia génica son un método mediante el cual se pueden insertar, modificar o eliminar genes en organismos utilizando lentivirus .
Los lentivirus son una familia de virus responsables de enfermedades como el SIDA , que infectan insertando ADN en el genoma de sus células huésped . [1] Muchos de estos virus han sido la base de la investigación que utiliza virus en terapia génica , pero el lentivirus es único en su capacidad de infectar células que no se dividen y, por lo tanto, tiene una gama más amplia de aplicaciones potenciales. [2] Los lentivirus pueden volverse endógenos (ERV), integrando su genoma en el genoma de la línea germinal del huésped, de modo que el virus sea heredado de ahí en adelante por los descendientes del huésped. Los científicos utilizan los mecanismos de infección del lentivirus para lograr un resultado deseado en la terapia génica. Los vectores lentivirales en terapia génica han sido pioneros por Luigi Naldini . [3] [4]
El lentivirus es un retrovirus , lo que significa que tiene un genoma de ARN monocatenario con una enzima transcriptasa inversa. Los lentivirus también tienen una envoltura viral con glicoproteínas salientes que ayudan a la adhesión a la membrana externa de la célula huésped. El virus contiene una molécula de transcriptasa inversa que realiza la transcripción del material genético viral al ingresar a la célula. Dentro del genoma viral hay secuencias de ARN que codifican proteínas específicas que facilitan la incorporación de las secuencias virales al genoma de la célula huésped. El gen "gag" codifica los componentes estructurales de las proteínas de la nucleocápside viral: las proteínas de la matriz (MA/p17), la cápside (CA/p24) y la nucleocápside (NC/p7). El dominio "pol" codifica las enzimas transcriptasa inversa e integrasa. Por último, el dominio "env" del genoma viral codifica las glicoproteínas y la envoltura en la superficie del virus. [1] [ cita completa requerida ]
La infección y replicación de un lentivirus en una célula huésped implica múltiples pasos. En el primer paso, el virus utiliza sus glucoproteínas de superficie para unirse a la superficie externa de una célula. Más específicamente, los lentivirus se unen a las glucoproteínas CD4 de la superficie de la célula diana de un huésped. A continuación, el material viral se inyecta en el citoplasma de la célula huésped. Dentro del citoplasma, la enzima transcriptasa inversa viral realiza la transcripción inversa del genoma de ARN viral para crear un genoma de ADN viral. A continuación, el ADN viral se envía al núcleo de la célula huésped, donde se incorpora al genoma de la célula huésped con la ayuda de la enzima viral integrasa . A partir de ese momento, la célula huésped comienza a transcribir todo el ARN viral y a expresar las proteínas virales estructurales, en particular las que forman la cápside y la envoltura virales. A continuación, el ARN lentiviral y las proteínas virales se ensamblan y los viriones recién formados abandonan la célula huésped cuando se han producido suficientes. [ cita requerida ]
Se han propuesto dos métodos de terapia génica con lentivirus. En la metodología ex vivo, se extraen células de un paciente y luego se cultivan. Luego se introduce en el cultivo un vector lentiviral que porta transgenes terapéuticos para infectarlas. Las células ahora modificadas continúan en cultivo hasta que se pueden infundir en el paciente. La terapia génica in vivo es la inyección de muestras de vectores virales que contienen transgenes en el paciente. [5]
Los lentivirus se modifican para que actúen como un vector para insertar genes beneficiosos en las células. A diferencia de otros retrovirus, que no pueden penetrar la envoltura nuclear y, por lo tanto, solo pueden actuar sobre las células mientras están en mitosis , los lentivirus pueden infectar células independientemente de si se están dividiendo o no (lo que se ha demostrado que se debe en gran medida a la proteína de la cápside). [6] Muchos tipos de células, como las neuronas , no se dividen en organismos adultos, por lo que la terapia génica lentiviral es una buena candidata para tratar las afecciones que afectan a esos tipos de células. [7]
Se han realizado algunas aplicaciones experimentales de vectores lentivirales [8] en terapia génica para curar enfermedades como la diabetes mellitus , la hemofilia A murina, el cáncer de próstata , la enfermedad granulomatosa crónica y las enfermedades vasculares . [ cita requerida ]
Los vectores lentivirales derivados del VIH se han desarrollado ampliamente por su capacidad de dirigirse a genes específicos a través del coactivador PSIP1 . [9] Esta especificidad del objetivo permite el desarrollo de vectores genéticos lentivirales que no conllevan el riesgo de insertarse aleatoriamente en genes que funcionan normalmente. Como el VIH es patógeno, debe modificarse genéticamente para eliminar sus propiedades patógenas y su capacidad de replicarse. Esto se puede lograr eliminando genes virales que no son necesarios para la transducción de transgenes terapéuticos. Se ha propuesto que al dirigirse a los dominios "gag" y "env", se puede eliminar una parte suficiente del genoma del VIH-1 sin perder su eficacia en la terapia génica, al tiempo que se minimizan los genes virales integrados en el paciente. [10] Los genes también se pueden reemplazar en lugar de alterar como otro método para reducir los riesgos asociados con el uso del VIH-1. [7]
Se han desarrollado otros lentivirus, como el virus de inmunodeficiencia felina [11] y el virus de la anemia infecciosa equina [12], para su uso en terapia génica y son de interés debido a su incapacidad de causar enfermedades graves en huéspedes humanos. Se ha demostrado que el virus de la anemia infecciosa equina, en particular, tiene un rendimiento algo mejor que el VIH-1 en las células madre hematopoyéticas [13].
Históricamente, los vectores lentivirales incluían promotores virales fuertes que tenían un efecto secundario de mutagénesis insercional , mutaciones del ADN nuclear que afectan la función de un gen. [14] Se demostró que estos promotores virales fuertes eran la principal causa de la formación del cáncer . [14] Como resultado, los promotores virales han sido reemplazados por promotores celulares y secuencias reguladoras. [14]
Como se mencionó, los lentivirus tienen la capacidad única de infectar células que no se dividen. Más allá de eso, existen otras propiedades que distinguen a los vectores lentivirales de otros vectores virales. Es importante tener en cuenta dichas propiedades al determinar si los lentivirus son apropiados para un tratamiento determinado.
Los gammaretrovirus son retrovirus similares a los lentivirus. Los virus de la leucemia murina (MLV) fueron de los primeros en ser investigados para su uso en terapia génica. Sin embargo, investigaciones recientes han favorecido a los lentivirus por su capacidad de integrarse en células que no se dividen. En términos más prácticos, los gammaretrovirus tienen una afinidad para integrarse cerca de promotores de oncogenes , lo que genera un riesgo adverso de tumores. [15] Los MLV pueden ser competentes para la replicación, lo que significa que pueden replicarse en la célula huésped. Estos virus competentes para la replicación ofrecen transferencia génica estable y una orientación específica a tumores y tejidos. [16]
En la terapia génica, los adenovirus se diferencian de los lentivirus en muchos aspectos, algunos de los cuales ofrecen ventajas sobre los lentivirus. La eficiencia de transducción es mayor en los adenovirus en comparación con los lentivirus. [5] En segundo lugar, la mayoría de las células humanas tienen receptores para adenovirus [17] probablemente como resultado de la amplia variedad de enfermedades adenovirales en humanos. Sin embargo, esto presenta un inconveniente [ editorializing ] - como los adenovirus infectan frecuentemente a los humanos, esto genera una respuesta inmune en el cuerpo. Tal respuesta puede reducir la eficiencia de las terapias con vectores adenovirales y puede resultar en reacciones adversas como inflamación de los tejidos. [18] Se han realizado investigaciones para explotar esta respuesta inmune para atacar células cancerosas y desarrollar vacunas. [19] También se han desarrollado híbridos adenovirus-retrovirus (específicamente MLV) para explotar los beneficios de MLV y adenovirus. [20]
La variante deficiente en ADA de la inmunodeficiencia combinada grave (SCID) fue tratada con gran éxito en un estudio de varios años publicado en 2021. Más del 95 % de los pacientes tratados continuaron sin complicaciones después de 36 meses y el 100 % de los pacientes sobrevivieron a esta enfermedad normalmente letal. Se utilizó un vector lentiviral autoinactivante, EFS-ADA LV, para insertar un gen ADA funcional en células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) CD34+ autólogas. [21]
En un estudio diseñado para mejorar los resultados del trasplante vascular mediante terapia génica de células endoteliales vasculares, la tercera generación de lentivirus demostró ser eficaz en la administración de genes a injertos venosos moderados y trasplantes en procedimientos como el bypass de la arteria coronaria. Debido a que el virus se ha adaptado para perder la mayor parte de su genoma, el virus se vuelve más seguro y más eficaz en el trasplante de los genes necesarios en la célula huésped. Un inconveniente de esta terapia se explica en el estudio: la expresión génica a largo plazo puede requerir el uso de promotores y puede ayudar a una mayor expresión de transgenes. Los investigadores lograron esto mediante la adición de plásmidos autoinactivantes y la creación de un tropismo más universal mediante la pseudotipificación de una glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular. [22]
En la enfermedad granulomatosa crónica (EGC), el funcionamiento inmunológico es deficiente como resultado de las mutaciones en los componentes de la enzima nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidasa ( NADPH oxidasa ) en las células fagocíticas , que cataliza la producción de radicales libres superóxido . Si esta enzima se vuelve deficiente, los fagocitos no pueden matar eficazmente a las bacterias engullidas, por lo que se pueden formar granulomas . Un estudio realizado en ratones enfatiza el uso de vectores lentivirales específicos de linaje para expresar una versión normal de una de las proteínas EGC mutantes, lo que permite que los glóbulos blancos produzcan ahora una versión funcional de la NADPH oxidasa. Los científicos desarrollaron esta cepa de lentivirus transinfectando células 293T con virus pseudotipados con la proteína G de la estomatitis vesicular. La responsabilidad del vector viral era aumentar la producción de un gen funcional de la NADPH oxidasa en estas células fagocíticas. Hicieron esto para crear una afinidad por las células mieloides. [23]
En el caso del cáncer de próstata, el lentivirus se transforma al unirse al trastuzumab para unirse a las líneas celulares de cáncer de próstata humano LNCaP sensibles a los andrógenos y C4-2 resistentes a la castración. Estas dos células son las principales responsables de la secreción del exceso del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano ( HER-2 ), que es una hormona vinculada al cáncer de próstata. Al unirse a estas células y cambiar sus genomas, el lentivirus puede ralentizar, e incluso matar, las células causantes del cáncer. Los investigadores provocaron la especificidad del vector manipulando la región Fab del genoma viral y lo pseudotipificaron con el virus Sindbis. [24]
La hemofilia A también se ha estudiado en terapia génica con un vector lentiviral en ratones. El vector se dirige a las células hematopoyéticas para aumentar la cantidad de factor VIII, que se ve afectado en la hemofilia A. Pero esto sigue siendo un tema de estudio ya que el vector lentiviral no logró completamente este objetivo. Lo hicieron transinfectando el virus en una célula 293T, creando un virus conocido como 2bF8 que expresa la generación de vectores virales. [25]
Los estudios también han demostrado que la inyección de un vector lentiviral con genes que expresan IL-10 en el útero de ratones puede suprimir y prevenir la artritis reumatoide y crear nuevas células con expresión génica constante. Esto contribuye a los datos sobre células madre y la inoculación en el útero de vectores virales para terapia génica. El objetivo del vector viral en este estudio fueron las células sinoviales. Las células sinoviales que funcionan normalmente producen TNFα e IL-1 . [26]
Al igual que muchos de los estudios realizados en el útero, la terapia génica con vectores lentivirales para la diabetes mellitus es más eficaz en el útero, ya que las células madre que se ven afectadas por la terapia génica crean nuevas células con el nuevo gen creado por la intervención viral real. El vector se dirige a las células dentro del páncreas para agregar genes secretores de insulina para ayudar a controlar la diabetes mellitus. Los vectores se clonaron utilizando un promotor de citomegalovirus y luego se cotransfectaron en la célula 293T. [27]
Como las neuronas maduras no se dividen, los lentivirus son ideales para la terapia génica independiente de la división. Se han realizado estudios de terapia génica lentiviral en pacientes con enfermedad de Parkinson avanzada [28] y atrofia neuronal relacionada con el envejecimiento en primates. [29]