La proteína reparadora de ADN XRCC4 ( hXRCC4 ), también conocida como proteína 4 de complementación cruzada de reparación de rayos X , es una proteína que en los humanos está codificada por el gen XRCC4 . XRCC4 también se expresa en muchos otros animales , hongos y plantas . [5] hXRCC4 es una de varias proteínas centrales involucradas en la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ) para reparar roturas de doble cadena de ADN (DSB). [6] [7] [8]
La NHEJ requiere dos componentes principales para lograr una finalización exitosa. El primer componente es la unión cooperativa y la fosforilación de artemis por la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de ADN ( DNA-PKcs ). Artemis corta los extremos del ADN dañado para prepararlo para la ligación . El segundo componente implica la unión del ADN a la ADN ligasa 4 , por hXRCC4, con la ayuda de Cernunnos-XLF . DNA-PKcs y hXRCC4 están anclados al heterodímero Ku70 / Ku80 , que están unidos a los extremos del ADN. [9]
Dado que hXRCC4 es la proteína clave que permite la interacción de la ADN ligasa 4 con el ADN dañado y, por lo tanto, la ligadura de los extremos, se descubrió que las mutaciones en el gen XRCC4 causaban letalidad embrionaria en ratones e inhibición del desarrollo e inmunodeficiencia en humanos. [9] Además, ciertas mutaciones en XRCC4 están asociadas con un mayor riesgo de cáncer. [10]
Las roturas de doble cadena (DSB) son causadas principalmente por radicales libres generados a partir de la radiación ionizante en el medio ambiente y de subproductos liberados continuamente durante el metabolismo celular. Las DSB que no se reparan de manera eficiente pueden resultar en la pérdida de genes codificadores de proteínas importantes y secuencias reguladoras requeridas para la expresión génica necesaria para la vida de una célula. [8] [11] Las DSB que no pueden depender de un cromosoma hermano recién copiado generado por la replicación del ADN para llenar el vacío entrarán en la vía NHEJ . Este método de reparación es esencial ya que es un último recurso para prevenir la pérdida de largos tramos del cromosoma. [8] [12] La NHEJ también se utiliza para reparar DSB generadas durante la recombinación V(D)J cuando las regiones génicas se reorganizan para crear los sitios de unión a antígeno únicos de los anticuerpos y los receptores de células T. [8]
El daño del ADN ocurre muy frecuentemente y se genera a partir de la exposición a una variedad de fuentes genotóxicas tanto exógenas como endógenas. [11] Una de estas incluye la radiación ionizante , como la radiación gamma y los rayos X , que ionizan los grupos desoxirribosa en la cadena principal del ADN y pueden inducir DSB. [8] Las especies reactivas de oxígeno (ROS), como el superóxido (O 2 – • ), el peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ), los radicales hidroxilo (HO • ) y el oxígeno singlete ( 1 O 2 ), también pueden producir DSB como resultado de la radiación ionizante, así como de los procesos metabólicos celulares que ocurren de forma natural. [13] Los DSB también pueden ser causados por la acción de la ADN polimerasa al intentar replicar el ADN sobre una muesca que se introdujo como resultado del daño del ADN. [8] [11]
Existen muchos tipos de daño en el ADN , pero los DSB, en particular, son los más dañinos, ya que ambas cadenas están completamente desunidas del resto del cromosoma . Si no existe un mecanismo de reparación eficiente, los extremos del ADN pueden acabar degradándose, lo que lleva a una pérdida permanente de la secuencia. [8] Un hueco de doble cadena en el ADN también impedirá que se lleve a cabo la replicación , lo que dará como resultado una copia incompleta de ese cromosoma específico , que apunta a la célula para la apoptosis . Al igual que con todos los daños en el ADN, los DSB pueden introducir nuevas mutaciones que, en última instancia, pueden conducir al cáncer . [8] [11]
Existen dos métodos para reparar las roturas de doble cadena, dependiendo de cuándo se produzca el daño durante la mitosis . [6] Si la rotura de doble cadena se produce después de que la replicación del ADN haya completado la fase S del ciclo celular , la vía de reparación de la rotura de doble cadena utilizará la recombinación homóloga apareándose con la cadena hija recién sintetizada para reparar la rotura. Sin embargo, si la rotura de doble cadena se genera antes de la síntesis del cromosoma hermano, la secuencia de plantilla requerida estará ausente. [8] Para esta circunstancia, la vía NHEJ proporciona una solución para reparar la rotura y es el sistema principal utilizado para reparar las roturas de doble cadena en humanos y eucariotas multicelulares. [6] [8] [9] [13] Durante la NHEJ, tramos muy cortos de ADN complementario, un par de bases o más a la vez, se hibridan entre sí y se eliminan los salientes. Como resultado, esta región específica del genoma se pierde permanentemente y la eliminación puede provocar cáncer y envejecimiento prematuro. [8] [12]
XRCC4 se encuentra en el cromosoma 5 , específicamente en 5q14.2. Este gen contiene ocho exones y tres variantes de transcripción de ARNm , que codifican dos isoformas proteicas diferentes . La variante de transcripción 1, ARNm, RefSeq NM_003401.3, tiene 1688 pb de longitud y es la más corta de las tres variantes. Le falta una secuencia corta en la región codificante 3' en comparación con la variante 2. La isoforma 1 contiene 334 aminoácidos . La variante de transcripción 2, ARNm, RefSeq NM_022406, tiene 1694 pb de longitud y codifica la isoforma 2 más larga, que contiene 336 aminoácidos . La variante de transcripción 3, RefSeq NM_022550.2, tiene 1735 pb y es la más larga, pero también codifica la misma isoforma 1 que la variante 1. Contiene una secuencia adicional en el 5'UTR de la transcripción del ARNm y carece de una secuencia corta en la región codificante 3' en comparación con la variante 2. [14]
El hXRCC4 es un tetrámero que se asemeja a la forma de una mancuerna y que contiene dos extremos globulares separados por un tallo largo y delgado. El tetrámero está compuesto por dos dímeros y cada dímero está formado por dos subunidades similares . La primera subunidad (L) contiene los residuos de aminoácidos 1–203 y tiene un tallo más largo que la segunda subunidad (S) que contiene los residuos 1–178.
Los dominios globulares N-terminales de cada subunidad son idénticos. Están formados por dos láminas beta antiparalelas que se enfrentan entre sí en una estructura tipo sándwich beta (es decir, un barril beta "aplanado" ) y están separadas por dos hélices alfa en un lado. El extremo N-terminal comienza con una lámina beta compuesta por las hebras 1, 2, 3 y 4, seguida de un motivo de hélice-giro-hélice de las dos hélices alfa, αA y αB, que continúa en las hebras 5, 6, 7 y termina con un tallo helicoidal alfa en el extremo C-terminal . αA y αB son perpendiculares entre sí y, debido a que un extremo de αB está parcialmente insertado entre las dos láminas beta, hace que se abran y se alejen una de la otra. La estructura tipo sándwich beta se mantiene unida mediante tres enlaces de hidrógeno entre las cadenas antiparalelas 4 y 7 y un enlace de hidrógeno entre las cadenas 1 y 5.
Los dos tallos helicoidales entre las subunidades L y S se entrelazan con un único cruce levógiro en la parte superior, cerca de los dominios globulares, formando una configuración de palmera. Esta región interactúa con las dos hélices alfa del segundo dímero en una orientación opuesta para formar un haz de cuatro hélices y el tetrámero con forma de mancuerna. [15]
Para que hXRCC4 sea secuestrado del citoplasma al núcleo para reparar un DSB durante NHEJ o para completar la recombinación V(D)J , se requiere una modificación postraduccional en la lisina 210 con un pequeño modificador relacionado con la ubiquitina (SUMO), o sumoilación . La modificación SUMO de diversos tipos de proteínas de reparación del ADN se puede encontrar en topoisomerasas , glicosilasa de escisión de bases TDG, Ku70/80 y helicasa BLM . Se encuentra que un motivo conservado común es típicamente un objetivo de la modificación SUMO, ΨKXE (donde Ψ es un aminoácido voluminoso e hidrofóbico ). En el caso de la proteína XRCC4, la secuencia de consenso que rodea a la lisina 210 es IKQE. Las células de ovario de hámster chino , CHO, que expresan la forma mutada de XRCC4 en K210 no pueden modificarse con SUMO, no logran ser reclutadas al núcleo y, en cambio, se acumulan en el citoplasma. Además, estas células son sensibles a la radiación y no completan con éxito la recombinación V(D)J. [7]
Tras la generación de un DSB, las proteínas Ku se moverán a través del citoplasma hasta que encuentren el sitio de la ruptura y se unan a él. [16] Ku recluta a XRCC4 y Cer-XLF y ambas proteínas interactúan cooperativamente entre sí a través de residuos específicos para formar un complejo de poro de nucleoproteína que envuelve el ADN. Cer-XLF es un homodímero que es muy similar a XRCC4 en la estructura y el tamaño de sus dominios N-terminal y C-terminal . Los residuos arginina 64, leucina 65 y leucina 115 en Cer-XLF interactúan con las lisinas 65 y 99 en XRCC4 dentro de sus dominios N-terminales. Juntos forman un haz de filamentos que envuelve el ADN en un patrón alterno. La hiperfosforilación de los dominios alfa helicoidales C-terminales de XRCC4 por DNA-PKcs facilita esta interacción. El dímero XRCC4 se une a un segundo dímero en una cadena de ADN adyacente para crear un tetrámero para la unión del ADN en las primeras etapas de la NHEJ. Antes de la ligadura , Lig IV se une al tallo C-terminal de XRCC4 en el sitio de la ruptura y desplaza el segundo dímero XRCC4. [9] El dominio BRCT2 de Lig IV se une con XRCC4 en este dominio a través de múltiples residuos e introduce un pliegue en las dos colas helicoidales alfa. La abrazadera hélice-bucle-hélice conectada al conector BRCT también hace contactos extensos. [17]
El proceso de NHEJ involucra a XRCC4 y una serie de proteínas estrechamente acopladas que actúan en conjunto para reparar el DSB. El sistema comienza con la unión de una proteína heterodímera llamada Ku70/80 a cada extremo del DSB para mantenerlos juntos en preparación para la ligadura y evitar su degradación. [8] [18] Ku70/80 luego secuestra una subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de ADN (DNA-PKcs) a los extremos del ADN para permitir la unión de la proteína Artemis a un extremo de cada DNA-PKcs. [8] [9] [17] Un extremo de la DNA-PKcs se une para estabilizar la proximidad del DSB y permitir que regiones muy cortas de complementariedad del ADN se hibriden. [8] [9] Luego, la DNA-PKcs fosforila a Artemis en una serina / treonina para activar su actividad exonucleasa y escindir nucleótidos en las colas de cadena simple que no están hibridadas en una dirección 5' a 3'. [8] [17] Dos proteínas XRCC4 se modifican postraduccionalmente para el reconocimiento y localización en Ku70/80 (5). Las dos proteínas XRCC4 se dimerizan juntas y se unen a Ku70/80 en los extremos de las cadenas de ADN para promover la ligación. XRCC4 luego forma un complejo fuerte con la ADN ligasa IV, LigIV, que se mejora mediante el factor similar a XRCC4 de Cernunnos, Cer-XLF. [9] [17] Cer-XLF solo se une a XRCC4 sin interacción directa con LigIV. LigIV luego se une a los extremos del ADN catalizando un enlace fosfodiéster covalente . [8] [17]
La recombinación V(D)J es la reorganización de múltiples segmentos genéticos distintos en el ADN de la línea germinal para producir los dominios proteicos únicos de las células inmunes , las células B y las células T , que reconocerán específicamente antígenos extraños como virus , bacterias y eucariotas patógenos . Las células B producen anticuerpos que se secretan en el torrente sanguíneo y las células T producen receptores que, una vez traducidos, se transportan a la bicapa lipídica externa de la célula. Los anticuerpos se componen de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas. El sitio de unión del antígeno consta de dos regiones variables, VL y VH. El resto de la estructura del anticuerpo se compone de regiones constantes, CL, CH, CH2 y CH3. El locus Kappa en el ratón codifica una cadena ligera de anticuerpo y contiene aproximadamente 300 segmentos genéticos para la región variable, V, cuatro segmentos J que codifican una región proteica corta y un segmento constante, C. Para producir una cadena ligera con un tipo único de VL, cuando las células B se están diferenciando, el ADN se reorganiza para incorporar una combinación única de los segmentos V y J. El empalme del ARN une la región recombinada con el segmento C. El gen de la cadena pesada también contiene numerosos segmentos de diversidad, D, y múltiples segmentos constantes, Cμ, Cδ, Cγ, Cε, Cα. La recombinación se produce en una región específica del gen que se encuentra entre dos motivos de secuencia conservados llamados secuencias de señal de recombinación. Cada motivo está flanqueado por una secuencia de 7 pb y 9 pb que está separada por un espaciador de 12 pb, denominado clase 1, o un espaciador de 23 pb, denominado clase 2. Una recombinasa compuesta por subunidades RAG1 y RAG2 siempre se escinde entre estos dos sitios. La escisión da como resultado dos estructuras de horquilla para los segmentos V y J, respectivamente, y la región no codificante, ahora está separada de los segmentos V y J por un DSB. La región codificante de la horquilla pasa por el proceso de NHEJ donde el extremo cerrado se escinde y repara. La región no codificante se circulariza y se degrada. [6] [8] Por lo tanto, NHEJ también es importante en el desarrollo del sistema inmunológico a través de su papel en la recombinación V(D)J. [19]
Estudios recientes han demostrado una asociación entre XRCC4 y una posible susceptibilidad a una variedad de patologías. La relación observada con más frecuencia es entre las mutaciones de XRCC4 y la susceptibilidad a cánceres como el cáncer de vejiga, el cáncer de mama y los linfomas. Los estudios también han señalado una posible relación entre la mutación de XRCC4 y la endometriosis. La autoinmunidad también se está estudiando a este respecto. La relación entre las mutaciones de XRCC4 y ciertas patologías puede proporcionar una base para biomarcadores de diagnóstico y, eventualmente, el posible desarrollo de nuevas terapias.
Los polimorfismos de XRCC4 se han vinculado a un riesgo de susceptibilidad a cánceres como el cáncer de vejiga , [20] cáncer de mama , [21] cáncer de próstata , carcinoma hepatocelular , linfomas y mieloma múltiple . [22] Con respecto al cáncer de vejiga, por ejemplo, el vínculo entre XRCC4 y el riesgo de susceptibilidad al cáncer se basó en estudios histológicos de casos y controles basados en hospitales de variantes genéticas de XRCC4 y XRCC3 y su posible asociación con el riesgo de cáncer de vejiga urotelial. El vínculo con el riesgo de susceptibilidad al cáncer de vejiga urotelial se demostró para XRCC4, pero no para XRCC3 [20] Con respecto al cáncer de mama, el vínculo con "riesgo aumentado de cáncer de mama" se basó en un examen de polimorfismos funcionales del gen XRCC4 realizado en conexión con un metanálisis de cinco estudios de casos y controles. [21] También hay al menos un estudio histológico de casos y controles basado en un hospital que indica que los polimorfismos en XRCC4 pueden tener una "influencia" en la susceptibilidad al cáncer de próstata. [23] La deleción condicional (mediada por CD21-cre) del gen NHEJ de XRCC4 en células B periféricas de ratón deficientes en p53 resultó en linfomas de células B de superficie negativos a Ig, y estos linfomas a menudo tenían una "translocación cromosómica recíproca" que fusionaba IgH con Myc (y también tenían "grandes deleciones o translocaciones cromosómicas" que involucraban IgK o IgL , con IgL "fusionándose" con oncogenes o con IgH). [24] Los linfomas pro-B deficientes en XRCC4 y p53 "activan rutinariamente c-myc mediante amplificación genética"; y además, los linfomas periféricos de células B deficientes en XRCC4 y p53 "activan ectópicamente de manera rutinaria" una única copia de c-myc. [24] De hecho, en vista de la observación de algunos de que "las enzimas reparadoras del ADN son correctivas del daño del ADN inducido por carcinógenos y fármacos contra el cáncer", [25] no debería sorprender que "los SNP en los genes de reparación del ADN puedan desempeñar un papel importante" en la susceptibilidad al cáncer. [25] Además de los cánceres identificados anteriormente, se ha identificado que los polimorfismos de XRCC4 tienen un vínculo potencial con varios cánceres adicionales, como el cáncer oral , el cáncer de pulmón , el cáncer gástrico y los gliomas . [25]
La disminución de la capacidad de reparación de roturas de doble cadena de ADN por parte de NHEJ puede ser un factor significativo en el proceso de envejecimiento . Li et al. [26] descubrieron que, en los seres humanos, la eficiencia de la reparación de NHEJ disminuye entre los 16 y los 75 años. Su estudio indicó que la menor expresión de XRCC4 y otras proteínas NHEJ impulsa una disminución asociada con la edad en la eficiencia y fidelidad de NHEJ. Sugirieron que la disminución relacionada con la edad en la expresión de XRCC4 puede contribuir a la senescencia celular.
Con base en los hallazgos de que (1) varios polipéptidos en la vía NHEJ son "objetivos potenciales de autoanticuerpos" y (2) "uno de los epítopos autoinmunes en XRCC4 coincide con una secuencia que es un nexo para eventos regulatorios inducidos por radiación", se ha sugerido que la exposición a agentes que introducen roturas de doble cadena de ADN "puede ser uno de los factores" que median las respuestas autoinmunes. [27] [28]
Se ha especulado que "los genotipos y alelos relacionados con el codón 247*A de XRCC4 y el promotor -1394*T de XRCC4... podrían estar asociados con mayores susceptibilidades y patogénesis de la endometriosis". [29]
En vista de las posibles asociaciones de los polimorfismos de XRCC4 con el riesgo de susceptibilidad al cáncer (ver discusión anterior), XRCC4 podría usarse como un biomarcador para la detección del cáncer , particularmente con respecto al cáncer de próstata, cáncer de mama y cáncer de vejiga. [20] De hecho, los polimorfismos de XRCC4 fueron identificados específicamente como poseedores del potencial de ser nuevos marcadores útiles para la "prevención primaria e intervención anticancerígena" en el caso del cáncer de vejiga urotelial. [20]
En vista del papel de XRCC4 en la reparación de roturas de doble cadena de ADN , se ha investigado la relación entre la función alterada de XRCC4 y la radiosensibilización de las células tumorales. Por ejemplo, se ha informado que " la selección de secuencias codificantes y no codificantes mediada por RNAi en los mensajes de los genes de reparación de ADN radiosensibiliza eficazmente las células tumorales humanas". [30]
En la literatura se ha debatido el papel potencial de XRCC4 en el desarrollo de nuevas terapias. Por ejemplo, Wu et al. han sugerido que, dado que el gen XRCC4 es "fundamental en NHEJ" y está "positivamente asociado con la susceptibilidad al cáncer", algunos SNP de XRCC4 como G-1394T (rs6869366) "pueden servir como un SNP común para detectar y predecir varios cánceres (hasta ahora para cánceres de mama, gástrico y de próstata...)"; y, aunque se necesita más investigación, "pueden servir como objetivos candidatos para medicamentos anticancerígenos personalizados". [25] También se ha mencionado la posibilidad de detectar la endometriosis sobre esta base, y esto también puede conducir posiblemente al desarrollo eventual de tratamientos. [25] [29] Al evaluar otras posibilidades de tratamientos anticancerígenos, Wu et al . también comentaron sobre la importancia de los "co-tratamientos de agentes que dañan el ADN y radiación". [25] Específicamente, Wu et al . Observó que "el equilibrio entre el daño del ADN y la capacidad de los mecanismos de reparación del ADN determina el resultado terapéutico final" y "la capacidad de las células cancerosas para completar los mecanismos de reparación del ADN es importante para la resistencia terapéutica y tiene un impacto negativo en la eficacia terapéutica", y por lo tanto teorizó que "[l]a inhibición farmacológica de los objetivos recientemente detectados de reparación del ADN con varios compuestos de moléculas pequeñas... tiene el potencial de mejorar la citotoxicidad de los agentes anticancerígenos". [25]
En los seres humanos, las mutaciones en el gen XRCC4 causan enanismo primordial microcefálico, un fenotipo caracterizado por una marcada microcefalia, dismorfia facial, retraso del desarrollo y baja estatura. [31] Aunque la diversidad de la unión de inmunoglobulinas está alterada, estos individuos no muestran un fenotipo inmunológico reconocible. [31] [32] A diferencia de los individuos con una mutación LIG4, no se observa pancitopenia que resulte en insuficiencia de la médula ósea en individuos con deficiencia de XRCC4. [32] A nivel celular, la alteración de XRCC4 induce hipersensibilidad a agentes que inducen roturas de doble cadena, reparación defectuosa de roturas de doble cadena y aumento de la apoptosis después de la inducción de daño al ADN. [31]
Se han desarrollado anticuerpos anti-XRCC4, incluidos anticuerpos fosfoespecíficos para pS260 y pS318 en XRCC4. [33] [34] Los anticuerpos contra XRCC4 pueden tener una variedad de usos, incluido el uso en inmunoensayos para realizar investigaciones en áreas como daño y reparación del ADN, unión de extremos no homólogos, factores de transcripción, epigenética y señalización nuclear. [34] [35]
Las investigaciones realizadas en la década de 1980 revelaron que un mutante de célula de ovario de hámster chino (CHO) llamado XR-1 era "extremadamente sensible" con respecto a ser destruido por rayos gamma durante la porción G1 del ciclo celular pero, en los mismos estudios de investigación, mostró una "resistencia casi normal" al daño de los rayos gamma durante la fase S tardía; [36] y en el curso de esta investigación, la sensibilidad del ciclo celular de XR-1 se correlacionó con su incapacidad para reparar las roturas de doble cadena de ADN producidas por la radiación ionizante y las enzimas de restricción. [36] [37] [38] En particular, en un estudio que utilizó híbridos de células somáticas de células XR-1 y fibroblastos humanos, Giaccia et al. (1989) demostraron que la mutación XR-1 era una mutación recesiva; [38] y en el seguimiento de este trabajo, Giaccia et al. (1990) llevaron a cabo estudios adicionales examinando la mutación XR-1 (nuevamente usando híbridos de células somáticas formados entre XR-1 y fibroblastos humanos) y pudieron mapear el gen complementario humano al cromosoma 5 usando análisis de segregación cromosómica. [39] Giaccia et al , asignaron tentativamente a este gen humano el nombre "XRCC4" (una abreviatura de "gen 4 del hámster chino que complementa los rayos X") y determinaron que (a) el gen XRCC4 recientemente nombrado restauró bioquímicamente el defecto del hámster a niveles normales de resistencia a la radiación de rayos gamma y bleomicina y (b) el gen XRCC4 restauró la competencia para reparar los DSB del ADN. [39] Con base en estos hallazgos, Giaccia et al. propusieron que XRCC4, como un solo gen, era responsable del fenotipo XR-1. [39]
Este artículo incorpora texto de la Biblioteca Nacional de Medicina de los Estados Unidos , que se encuentra en el dominio público .