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Microscopía de excitación de dos fotones

Microscopía de excitación de dos fotones de intestino de ratón . Rojo: actina . Verde: núcleos celulares . Azul: moco de células caliciformes . Obtenido a 780 nm utilizando un láser de zafiro de titanio .

La microscopía de excitación de dos fotones ( TPEF o 2PEF ) es una técnica de obtención de imágenes de fluorescencia que resulta especialmente adecuada para obtener imágenes de tejido vivo con dispersión de hasta aproximadamente un milímetro de espesor. A diferencia de la microscopía de fluorescencia tradicional , en la que la longitud de onda de excitación es más corta que la longitud de onda de emisión, la excitación de dos fotones requiere la excitación simultánea de dos fotones con una longitud de onda más larga que la luz emitida. El láser se enfoca en una ubicación específica del tejido y se escanea a través de la muestra para producir la imagen de forma secuencial. Debido a la no linealidad de la excitación de dos fotones, se excitan principalmente los fluoróforos en el foco de tamaño micrométrico del haz láser, lo que da como resultado la resolución espacial de la imagen. Esto contrasta con la microscopía confocal , en la que la resolución espacial se produce por la interacción del foco de excitación y la detección confinada con un orificio.

La microscopía de excitación de dos fotones generalmente utiliza luz de excitación de infrarrojo cercano (NIR) que también puede excitar colorantes fluorescentes . El uso de luz infrarroja minimiza la dispersión en el tejido porque la luz infrarroja se dispersa menos en los tejidos biológicos típicos. Debido a la absorción multifotónica, la señal de fondo se suprime fuertemente. Ambos efectos conducen a una mayor profundidad de penetración para esta técnica. La excitación de dos fotones puede ser una alternativa superior a la microscopía confocal debido a su penetración más profunda en el tejido, detección eficiente de la luz y fotoblanqueo reducido . [1] [2]

Imagen de fluorescencia de dos fotones (verde) de una sección transversal de rizoma coloreado con lirio de los valles . La excitación se produce a 840 nm y los colores rojo y azul representan otros canales de técnicas multifotónicas que se han superpuesto.

Concepto

Representación esquemática de los niveles de energía (diagramas de Jabłoński) del proceso de fluorescencia, ejemplo de un colorante fluorescente que emite luz a 460 nm. Se absorben uno (violeta, 1PEF), dos (rojo claro, 2PEF) o tres (rojo oscuro, 3PEF) fotones para emitir un fotón de fluorescencia (turquesa).
Respuesta óptica de una fuente puntual. De izquierda a derecha: distribuciones de intensidad calculadas xy (arriba) y rz (abajo), con escala logarítmica, para una fuente puntual captada mediante un microscopio de campo amplio (a), 2PEF (b) y confocal (c). Las formas 2PEF y confocal tienen una mejor relación señal-ruido que el campo amplio. La distribución 2PEF es mayor debido al hecho de que una longitud de onda dos veces más larga que en el caso de un campo amplio o confocal es responsable de la distribución de intensidad. Estas distribuciones de intensidad también se conocen como funciones de dispersión puntual. Condiciones ópticas: las longitudes de onda de excitación son 488 nm y 900 nm respectivamente para 1PEF y 2PEF; la longitud de onda de emisión es 520 nm; la apertura numérica es 1,3 con un objetivo de inmersión en aceite .

La excitación de dos fotones emplea la absorción de dos fotones , un concepto descrito por primera vez por Maria Goeppert Mayer (1906-1972) en su tesis doctoral en 1931, [3] y observado por primera vez en 1961 en un cristal CaF 2 :Eu 2+ utilizando excitación láser por Wolfgang Kaiser . [4] Isaac Abella demostró en 1962 en vapor de cesio que es posible la excitación de dos fotones de átomos individuales. [5]

La microscopía de fluorescencia de excitación de dos fotones tiene similitudes con otras técnicas de microscopía láser confocal, como la microscopía confocal de barrido láser y la microscopía Raman . Estas técnicas utilizan rayos láser enfocados escaneados en un patrón de trama para generar imágenes, y ambas tienen un efecto de seccionamiento óptico . A diferencia de los microscopios confocales, los microscopios multifotónicos no contienen aberturas de orificios estenopeicos que les dan a los microscopios confocales su calidad de seccionamiento óptico. El seccionamiento óptico producido por los microscopios multifotónicos es el resultado de la función de dispersión de puntos de la excitación. El concepto de excitación de dos fotones se basa en la idea de que dos fotones, de energía fotónica comparativamente menor que la necesaria para la excitación de un fotón, también pueden excitar un fluoróforo en un evento cuántico. Cada fotón transporta aproximadamente la mitad de la energía necesaria para excitar la molécula. El fotón emitido tiene una energía más alta (longitud de onda más corta) que cualquiera de los dos fotones excitantes. La probabilidad de la absorción casi simultánea de dos fotones es extremadamente baja. Por lo tanto, normalmente se requiere un flujo pico alto de fotones de excitación, generalmente generado por un láser pulsado de femtosegundos . Por ejemplo, la misma potencia láser promedio pero sin pulsación da como resultado una fluorescencia no detectable en comparación con la fluorescencia generada por el láser pulsado a través del efecto de dos fotones. Los láseres de excitación de longitud de onda más larga y menor energía (normalmente infrarrojos) de los microscopios multifotónicos son adecuados para su uso en la obtención de imágenes de células vivas, ya que causan menos daño que los láseres de longitud de onda corta que se utilizan normalmente para la excitación de un solo fotón, por lo que los tejidos vivos se pueden observar durante períodos más largos con menos efectos tóxicos.

Los fluoróforos más utilizados tienen espectros de excitación en el rango de 400 a 500 nm, mientras que el láser utilizado para excitar la fluorescencia de dos fotones se encuentra en el rango de ~700 a 1100 nm (infrarrojo) producido por los láseres de zafiro de titanio . Si el fluoróforo absorbe dos fotones infrarrojos simultáneamente, absorberá suficiente energía para elevarse al estado excitado. El fluoróforo emitirá entonces un solo fotón con una longitud de onda que depende del tipo de fluoróforo utilizado (normalmente en el espectro visible). Debido a que se absorben dos fotones durante la excitación del fluoróforo, la probabilidad de emisión fluorescente de los fluoróforos aumenta cuadráticamente con la intensidad de la excitación. Por lo tanto, se genera mucha más fluorescencia de dos fotones donde el haz láser está muy enfocado que donde es más difuso. Efectivamente, la excitación se restringe al pequeño volumen focal (~1 femtolitro), lo que resulta en un alto grado de rechazo de objetos desenfocados. Esta localización de la excitación es la ventaja clave en comparación con los microscopios de excitación de fotón único , que necesitan emplear elementos como orificios para rechazar la fluorescencia desenfocada. La fluorescencia de la muestra se recoge luego mediante un detector de alta sensibilidad, como un tubo fotomultiplicador . Esta intensidad de luz observada se convierte en un píxel en la imagen final; el punto focal se escanea a lo largo de una región deseada de la muestra para formar todos los píxeles de la imagen.

Desarrollo

Diagrama de un microscopio de dos fotones.

La microscopía de dos fotones fue desarrollada y patentada por Winfried Denk y James Strickler en el laboratorio de Watt W. Webb en la Universidad de Cornell en 1990. Combinaron la idea de la absorción de dos fotones con el uso de un escáner láser. [1] [6] En la microscopía de excitación de dos fotones, un haz de láser infrarrojo se enfoca a través de una lente objetivo. El láser de zafiro de titanio que se utiliza normalmente tiene un ancho de pulso de aproximadamente 100 femtosegundos (fs) y una frecuencia de repetición de unos 80 MHz, lo que permite la alta densidad de fotones y el flujo necesarios para la absorción de dos fotones, y es ajustable en una amplia gama de longitudes de onda.

El uso de luz infrarroja para excitar fluoróforos en tejidos que dispersan la luz tiene beneficios adicionales. [7] Las longitudes de onda más largas se dispersan en menor grado que las más cortas, lo que es un beneficio para la obtención de imágenes de alta resolución. Además, estos fotones de menor energía tienen menos probabilidades de causar daños fuera del volumen focal. En comparación con un microscopio confocal, la detección de fotones es mucho más eficaz, ya que incluso los fotones dispersos contribuyen a la señal utilizable. Estos beneficios para la obtención de imágenes en tejidos que dispersan la luz solo se reconocieron varios años después de la invención de la microscopía de excitación de dos fotones. [8]

Existen varias advertencias sobre el uso de la microscopía de dos fotones: los láseres pulsados ​​necesarios para la excitación de dos fotones son mucho más caros que los láseres de onda continua (CW) utilizados en la microscopía confocal. El espectro de absorción de dos fotones de una molécula puede variar significativamente de su contraparte de un fotón. El fotodaño de orden superior se convierte en un problema y el blanqueamiento se escala con el cuadrado de la potencia del láser, mientras que es lineal para el fotón único (confocal). Para objetos muy delgados como células aisladas, los microscopios de fotón único (confocal) pueden producir imágenes con mayor resolución óptica debido a sus longitudes de onda de excitación más cortas. En cambio, en la dispersión de tejido, las capacidades superiores de seccionamiento óptico y detección de luz del microscopio de dos fotones dan como resultado un mejor rendimiento.

Aplicaciones

Principal

La microscopía de dos fotones se ha utilizado en numerosos campos, entre ellos: fisiología, neurobiología, embriología e ingeniería de tejidos. Incluso tejidos delgados, casi transparentes (como células de la piel) se han visualizado con detalles claros gracias a esta técnica. [9] Las capacidades de obtención de imágenes de alta velocidad de la microscopía de dos fotones también se pueden utilizar en biopsias ópticas no invasivas. [10] La microscopía de dos fotones se ha utilizado adecuadamente para producir reacciones químicas localizadas, [8] y efecto que también se ha utilizado para la litografía basada en dos fotones . Utilizando la fluorescencia de dos fotones y la microscopía basada en la generación del segundo armónico , se demostró que las moléculas orgánicas de tipo porfirina pueden tener diferentes momentos dipolares de transición para la fluorescencia de dos fotones y la generación del segundo armónico, [11] que de otro modo se cree que ocurren a partir del mismo momento dipolar de transición. [12] Se demostró que la excitación no degenerativa de dos fotones, o el uso de 2 fotones de longitudes de onda desiguales, aumenta la fluorescencia de todas las moléculas pequeñas y proteínas fluorescentes probadas. [13]

Investigación sobre el cáncer

También se ha demostrado que el 2PEF es muy valioso para caracterizar el cáncer de piel , [14] además de monitorear el cáncer de mama in vitro. [15] [16] También se ha demostrado que revela el arresto de células tumorales, la interacción célula tumoral-plaqueta, la interacción célula tumoral-leucocito y los procesos de colonización metastásica. [17]

Investigación embrionaria

Se ha demostrado que la 2PEF es ventajosa con respecto a otras técnicas, como la microscopía confocal, cuando se trata de obtener imágenes a largo plazo de células vivas de embriones de mamíferos. [18]

Investigación sobre el riñón

La 2PEF también se ha utilizado para visualizar tipos de células de difícil acceso, especialmente en lo que respecta a las células renales. [19] Se ha utilizado para comprender mejor la dinámica de fluidos y la filtración. [20]

Determinación del nivel de infección viral

También se demostró que el 2PEF es una herramienta valiosa para monitorear los correlatos de la infección viral ( SARS-CoV-2 ) en cultivos celulares utilizando un colorante sensible al Ca 2+ activo en 2P . [21]

Diagrama de imágenes de la función cerebral in vivo. Muestra el esquema general de las imágenes, junto con imágenes neuronales y vasculares. Las imágenes se obtuvieron utilizando varios tintes fluorescentes.

Neurociencia

El método 2PEF, así como la extensión de este método al 3PEF, se utilizan para caracterizar tejidos neuronales intactos en el cerebro de animales vivos e incluso en comportamiento. En particular, el método es ventajoso para la obtención de imágenes de calcio de una neurona o poblaciones de neuronas, [22] para la fotofarmacología, incluida la liberación localizada de componentes como el glutamato [23] o la isomerización de fármacos fotoconmutables, [24] [25] y para la obtención de imágenes de otros sensores codificados genéticamente que informan sobre la concentración de neurotransmisores. [26]

Actualmente, la microscopía de dos fotones se utiliza ampliamente para obtener imágenes de la activación en vivo de neuronas en organismos modelo, incluidas moscas de la fruta ( Drosophila melanogaster ) , ratas , pájaros cantores , primates , hurones , ratones ( Mus musculus ) y peces cebra . [27] [28] [29] Los animales suelen tener la cabeza fija debido al tamaño del microscopio y los dispositivos de escaneo, pero también se están desarrollando microscopios en miniatura que permiten obtener imágenes de neuronas en animales en movimiento y que se comportan libremente. [30] [31]

Excitación de orden superior

También es posible la absorción simultánea de tres o más fotones, lo que permite una microscopía de excitación multifotónica de orden superior. [32] La denominada "microscopía de fluorescencia de excitación de tres fotones" (3PEF) es la técnica más utilizada después de la 2PEF, a la que es complementaria. También se ha informado de la isomerización localizada de fármacos fotoconmutables in vivo utilizando la excitación de tres fotones. [33]

Colorantes y proteínas fluorescentes para microscopía de excitación de dos fotones

En general, todas las proteínas fluorescentes de uso común (CFP, GFP, YFP, RFP) y los colorantes se pueden excitar en modo de dos fotones. Los espectros de excitación de dos fotones suelen ser considerablemente más amplios, lo que dificulta la excitación selectiva de los fluoróforos cambiando las longitudes de onda de excitación. [ cita requerida ]

Se han descrito varios colorantes emisores de luz verde, roja y NIR (sondas y etiquetas reactivas) con secciones transversales de absorción de 2 fotones extremadamente altas. [34] Debido a la estructura de tipo donante-aceptor-donante, los colorantes de esquaraína como Seta-670 , Seta-700 y Seta-660 exhiben eficiencias de absorción de 2 fotones (2PA) muy altas en comparación con otros colorantes, [34] [35] [36] SeTau-647 y SeTau-665 , un nuevo tipo de esquaraína - rotaxano , exhiben secciones transversales de acción de dos fotones extremadamente altas de hasta 10 000 GM en la región del IR cercano, insuperables por cualquier otra clase de colorantes orgánicos. [34]

Véase también

Fuentes

Referencias

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