Microscopía de tres fotones

La microscopía de tres fotones ( 3PEF ) es una microscopía de fluorescencia de alta resolución basada en el efecto de excitación no lineal. ^{[1] [2] [3]} A diferencia de la microscopía de excitación de dos fotones , utiliza tres fotones de excitación. Normalmente utiliza láseres de longitud de onda de 1300 nm o más para excitar los tintes fluorescentes con tres fotones absorbidos simultáneamente. Los tintes fluorescentes emiten entonces un fotón cuya energía es (ligeramente menor que) tres veces la energía de cada fotón incidente. En comparación con la microscopía de dos fotones, la microscopía de tres fotones reduce la fluorescencia lejos del plano focal en , que es mucho más rápido que el de la microscopía de dos fotones en . ^[4] Además, la microscopía de tres fotones emplea luz infrarroja cercana con menos efecto de dispersión de tejido . Esto hace que la microscopía de tres fotones tenga una resolución más alta que la microscopía convencional . ${\displaystyle 1/z^{4}}$ ${\displaystyle 1/z^{2}}$

Concepto

La fluorescencia excitada por tres fotones fue observada por primera vez por Singh y Bradley en 1964 cuando estimaron la sección transversal de absorción de tres fotones de los cristales de naftaleno. ^[5] En 1996, Stefan W. Hell diseñó experimentos para validar la viabilidad de aplicar la excitación de tres fotones a la microscopía de fluorescencia de barrido, lo que demostró aún más el concepto de fluorescencia excitada por tres fotones. ^[6]

La microscopía de tres fotones comparte algunas similitudes con la microscopía de excitación de dos fotones . Ambas emplean el método de escaneo puntual. Ambas pueden obtener imágenes de muestras en 3D ajustando la posición de la lente de enfoque a lo largo de las direcciones axial y lateral. Las estructuras de ambos sistemas no requieren un orificio para bloquear la luz desenfocada. Sin embargo, la microscopía de tres fotones se diferencia de la microscopía de excitación de dos fotones en su función de dispersión de puntos , resolución , profundidad de penetración, resistencia a la luz desenfocada y fuerza del fotoblanqueo .

En la excitación de tres fotones, el fluoróforo absorbe tres fotones casi simultáneamente. La longitud de onda del láser de excitación es de aproximadamente 1200 nm o más en la microscopía de tres fotones con la longitud de onda de emisión ligeramente más larga que un tercio de la longitud de onda de excitación. La microscopía de tres fotones tiene una penetración tisular más profunda debido a las longitudes de onda de excitación más largas y la excitación no lineal de orden superior. Sin embargo, un microscopio de tres fotones necesita un láser con mayor potencia debido a la sección transversal relativamente más pequeña de los colorantes para la excitación de tres fotones, que es del orden de . Esto es mucho más pequeño que las secciones transversales de excitación típicas de dos fotones de . ^[7] Los pulsos ultracortos suelen rondar los 100 fs. ${\displaystyle 10^{-82}{\text{cm}}^{6}(s/{\text{photon}})^{2}}$ ${\displaystyle 10^{-49}{\text{cm}}^{4}s/{\text{photon}}}$

Resolución

Para la microscopía de barrido de fluorescencia de tres fotones, la función de dispersión de intensidad de punto tridimensional (IPSF) se puede denotar como,

${\displaystyle h_{i}(\nu ,u)=\left|I_{1}(\nu /3,u/3)\right|^{3}I_{2}(\nu ,u)\otimes _{3}D}$, ^[8]

donde denota la operación de convolución 3-D, denota la sensibilidad de intensidad de un detector incoherente y denota la IPSF 3-D para la lente objetivo y la lente colectora en fluorescencia de fotón único, respectivamente. La IPSF 3-D se puede expresar en ${\displaystyle \otimes _{3}}$ ${\displaystyle D}$ ${\displaystyle I_{1}(\nu ,u)}$ ${\displaystyle I_{2}(\nu ,u)}$ ${\displaystyle I_{1}(\nu ,u)}$

${\displaystyle I_{1}(\nu ,u)=\left|\int _{0}^{1}2J_{0}(\nu \rho )\exp(iu/2)\rho d\rho \right|^{2}}$, ^[8]

donde es una función de Bessel de primera especie de orden cero. Las coordenadas axiales y radiales y están definidas por ${\displaystyle J_{0}}$ ${\displaystyle u}$ ${\displaystyle \nu }$

${\displaystyle u=(8\pi /\lambda _{f})z\sin ^{2}(\alpha _{0}/2)}$y

${\displaystyle \nu =(2\pi /\lambda _{f})r\ \sin \ \alpha _{0}}$, ^[8]

donde es la apertura numérica de la lente objetivo, es el desenfoque real y son las coordenadas radiales. ${\displaystyle \alpha _{0}}$ ${\displaystyle z}$ ${\displaystyle r}$

Acoplamiento con otras técnicas multifotónicas

Se pueden obtener imágenes correlativas utilizando diferentes esquemas multifotón, como 2PEF , 3PEF y generación de tercer armónico (THG), en paralelo (ya que las longitudes de onda correspondientes son diferentes, se pueden separar fácilmente en diferentes detectores). Luego se construye una imagen multicanal. ^[9]

3PEF también se compara con 2PEF : generalmente produce una degradación menor de la relación señal-fondo (SBR) con la profundidad, incluso si la señal emitida es menor que con 2PEF. ^[9]

Desarrollo

Después de que Singh y Bradley observaran la fluorescencia excitada de tres fotones y la validaran Hell, Chris Xu y Watt W. Webb informaron sobre la medición de las secciones transversales de excitación de varios cromóforos nativos e indicadores biológicos, e implementaron la fluorescencia excitada de tres fotones en la microscopía de barrido láser de células vivas. ^[10] En noviembre de 1996, David Wokosin aplicó la fluorescencia de excitación de tres fotones para obtener imágenes fijas de muestras biológicas in vivo.

En la década de 2010, se aplicó la microscopía de tres fotones para la obtención de imágenes de tejidos profundos utilizando longitudes de onda de excitación superiores a 1060 nm. En enero de 2013, Horton, Wang, Kobat y Xu inventaron la obtención de imágenes profundas in vivo de un cerebro de ratón intacto empleando el método de escaneo puntual en un microscopio de tres fotones en la ventana de longitud de onda larga de 1700 nm. ^[4] En febrero de 2017, Dimitre Ouzounov, Tainyu Wang y Chris Xu demostraron la obtención de imágenes de actividad profunda de neuronas marcadas con GCaMP6 en el hipocampo de un cerebro de ratón adulto intacto utilizando microscopía de tres fotones en la ventana de longitud de onda de 1300 nm. ^[11] En mayo de 2017, Rowlands aplicó la excitación de tres fotones de campo amplio al microscopio de tres fotones para una mayor profundidad de penetración. ^[12] En octubre de 2018, T Wang, D Ouzounov y C Xu pudieron obtener imágenes de la vasculatura y la actividad del calcio GCaMP6 utilizando un microscopio de tres fotones a través del cráneo intacto del ratón. ^[13]

Aplicaciones

La microscopía de tres fotones tiene campos de aplicación similares a la microscopía de excitación de dos fotones , incluyendo la neurociencia, ^[14] y la oncología. ^[15] Sin embargo, en comparación con la excitación estándar de un solo fotón o de dos fotones, la excitación de tres fotones tiene varios beneficios, como el uso de longitudes de onda más largas que reducen los efectos de la dispersión de la luz y aumentan la profundidad de penetración del haz de iluminación en la muestra. ^[16] La naturaleza no lineal de la microscopía de tres fotones confina el objetivo de excitación a un volumen más pequeño, lo que reduce la luz fuera de foco y minimiza el fotoblanqueo en la muestra biológica. ^[16] Estas ventajas de la microscopía de tres fotones le dan una ventaja en la visualización de la morfología y fisiología del tejido in vivo y ex vivo a nivel celular en lo profundo del tejido dispersado ^[4] y la obtención rápida de imágenes volumétricas. ^[17] En el estudio reciente, Xu ha demostrado el potencial de la obtención de imágenes de tres fotones para estudios no invasivos de sistemas biológicos vivos. ^[13] El artículo utilizó microscopía de fluorescencia de tres fotones en una ventana de excitación espectral de 1320 nm para obtener imágenes de la estructura y función del cerebro del ratón a través del cráneo intacto con alta resolución espacial y temporal (la FWHM lateral y axial fue de 0,96 μm y 4,6 μm) y grandes FOV (cientos de micrómetros), y a una profundidad sustancial (>500 μm). Este trabajo demuestra la ventaja de la excitación no lineal de orden superior para obtener imágenes a través de una capa altamente dispersante, además de la ventaja informada previamente de 3PM para obtener imágenes profundas de muestras densamente etiquetadas. También se ha informado y utilizado la isomerización localizada de fármacos fotoconmutables in vivo utilizando excitación de tres fotones a 1560 nm para controlar la actividad neuronal de una manera farmacológicamente específica. ^[18]

Véase también

• Escaneo láser
• Óptica no lineal
• Microscopía de excitación de dos fotones

Referencias

1. Horton, Nicholas G.; Wang, Ke; Kobat, Demirhan; ​​Clark, Catharine G.; Wise, Frank W.; Schaffer, Chris B.; Xu, Chris (1 de marzo de 2013). "Microscopía de tres fotones in vivo de estructuras subcorticales dentro de un cerebro intacto de ratón". Nature Photonics . 7 (3): 205–209. Bibcode :2013NaPho...7..205H. doi :10.1038/nphoton.2012.336. PMC  3864872 . PMID  24353743.
2. Chen, Bingying; Huang, Xiaoshuai; Gou, Dongzhou; Zeng, Jianzhi; Chen, Guoqing; Pang, Meijun; Hu, Yanhui; Zhao, Zhe; Zhang, Yunfeng (29 de marzo de 2018). "Imagen volumétrica rápida con microscopía de tres fotones Bessel-Beam". Óptica Biomédica Express . 9 (4): 1992-2000. doi :10.1364/BOE.9.001992. PMC 5905939 . PMID  29675334. 
3. Williams, Rebecca M.; Shear, Jason B.; Zipfel, Warren R.; Maiti, Sudipta; Webb, Watt W. (1999-04-01). "Procesos de secreción de mastocitos mucosos obtenidos mediante microscopía de tres fotones de autofluorescencia de 5-hidroxitriptamina". Biophysical Journal . 76 (4): 1835–1846. Bibcode :1999BpJ....76.1835W. doi :10.1016/S0006-3495(99)77343-1. PMC 1300160 . PMID  10096882. 
4. Horton, Nicholas; Wang, Ke; Kobat, Demirhan; ​​Clark, Catharine; Wise, Frank; Schaffer, Chris; Xu, Chris (20 de enero de 2013). "Microscopía de tres fotones in vivo de estructuras subcorticales dentro de un cerebro de ratón intacto". Nature Photonics . 7 (3): 205–209. Bibcode :2013NaPho...7..205H. doi :10.1038/nphoton.2012.336. PMC 3864872 . PMID  24353743. 
5. Singh, S.; Bradley, LT (1 de junio de 1964). "Absorción de tres fotones en cristales de naftaleno [ sic ] mediante excitación láser". Physical Review Letters . 12 (22): 612–614. Código Bibliográfico :1964PhRvL..12..612S. doi :10.1103/PhysRevLett.12.612.
6. Hell, SW; Bahlmann, K; Schrader, M; Soini, A; Malak, HM; Gryczynski, I; Lakowicz, JR (1 de enero de 1996). "Excitación de tres fotones en microscopía de fluorescencia". Journal of Biomedical Optics . 1 (1): 71–74. Bibcode :1996JBO.....1...71H. doi : 10.1117/12.229062 . PMID  23014645.
7. Toda, Keisuke; Isobe, Keisuke; Namiki, Kana; Kawano, Hiroyuki; Miyawaki, Atsushi; Midorikawa, Katsumi (junio de 2017). "Microscopía de enfoque temporal utilizando fluorescencia de excitación de tres fotones con un amplificador de pulso chirped de fibra Yb de 92 fs". Biomedical Optics Express . 8 (6): 2796–2806. doi :10.1364/BOE.8.002796. PMC 5480430 . PMID  28663907. 
8. Gu, Min (1 de julio de 1996). "Resolución en microscopía de barrido de fluorescencia de tres fotones". Optics Letters . 21 (13): 988–990. Bibcode :1996OptL...21..988G. doi :10.1364/OL.21.000988. PMID  19876227.
9. Guesmi, Khmaies; Abdeladim, Lamiae; Tozer, Samuel; Mahou, Pierre; Kumamoto, Takuma; Jurkus, Karolis; Rigaud, Philippe; Loulier, Karine; Dray, Nicolas; Georges, Patrick; Hanna, Marc; Livet, Jean; Supatto, Willy; Beaurepaire, Emmanuel; Druon, Frédéric (2018). "Microscopía trifotónica de tejido profundo de doble color con un láser infrarrojo multibanda". Luz: ciencia y aplicaciones . 7 (1): 12. Bibcode :2018LSA.....7...12G. doi : 10.1038/s41377-018-0012-2 . ISSN  2047-7538. PMC 6107000 . PMID  30839589. 
10. Xu, C; Zipfel, W; Shear, JB; Williams, RM; Webb, WW (1 de octubre de 1996). "Excitación de fluorescencia multifotónica: nuevas ventanas espectrales para la microscopía biológica no lineal". Proc Natl Acad Sci USA . 93 (20): 10763–10768. Bibcode :1996PNAS...9310763X. doi :10.1073/pnas.93.20.10763. PMC 38229 . PMID  8855254. 
11. Ouzounov, Dimitre; Wang, Tianyu; Wang, Mengran; Feng, Danielle; Horton, Nicolás; Cruz-Hernández, Jean; Cheng, Yuting; Reimer, Jacob; Tolias, Andreas; Nishimura, Nozomi; Xu, Chris (20 de febrero de 2017). "Imágenes in vivo de tres fotones de la actividad de las neuronas marcadas con GCaMP6 en lo profundo del cerebro de ratón intacto". Métodos de la naturaleza . 14 (4): 388–390. doi :10.1038/nmeth.4183. PMC 6441362 . PMID  28218900. 
12. Rowlands, Christopher; Park, Demian; Bruns, Oliver; Piatkevich, Kiryl; Fukumura, Dai; Jain, Rakesh; Bawendi, Moungi; Boyden, Edward; So, Peter (5 de mayo de 2017). "Excitación de tres fotones de campo amplio en muestras biológicas". Luz: ciencia y aplicaciones . 6 (5): e16255. Bibcode :2017LSA.....6E6255R. doi :10.1038/lsa.2016.255. PMC 5687557 . PMID  29152380. ProQuest  1917694404. 
13. Wang, Tianyu; Ouzounov, Dimitre; Wu, Chunyan; Horton, Nicholas; Zhang, Bin; Wu, Cheng-Hsun; Zhang, Yanping; Schnitzer, Mark; Xu, Chris (10 de septiembre de 2018). "Imágenes de tres fotones de la estructura y función del cerebro del ratón a través del cráneo intacto". Nature Methods . 15 (10): 789–792. doi :10.1038/s41592-018-0115-y. PMC 6188644 . PMID  30202059. 
14. Kerr, Jason; Denk, Winfried (marzo de 2008). "Imágenes in vivo: observar el cerebro en acción". Nature Reviews Neuroscience . 9 (3): 195–205. doi :10.1038/nrn2338. PMID  18270513. S2CID  6301173.
15. Williams, Rebecca M.; Flesken-Nikitin, Andrea; Ellenson, Lora Hedrick; Connolly, Denise C.; Hamilton, Thomas C.; Nikitin, Alexander Yu.; Zipfel, Warren R. (junio de 2010). "Estrategias para la obtención de imágenes de alta resolución del cáncer epitelial de ovario mediante microscopía laparoscópica no lineal". Oncología Traslacional . 3 (3): 181–194. doi :10.1593/tlo.09310. PMC 2887648 . PMID  20563260. 
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17. Chen, Bingying; Huang, Xiaoshuai; Gou, Dongzhou; Zeng, Jianzhi; Chen, Guoqing; Pang, Meijun; Hu, Yanhui; Zhao, Zhe; Zhang, Yunfeng; Zhou, Zhuan; Wu, Haitao; Cheng, Heping; Zhang, Zhigang; Xu, Chris; Li, Yulong; Chen, Liangyi; Wang, Aimin (abril de 2018). "Imagen volumétrica rápida con microscopía de tres fotones Bessel-Beam". Óptica Biomédica Express . 9 (4): 1992-2000. doi : 10.1364/boe.9.001992. PMC 5905939 . PMID  29675334. 
18. Sortino, Rosalba; Cunquero, Marina; Castro-Olvera, Gustavo; Gelabert, Ricard; Moreno, Miguel; Riefolo, Fabio; Matera, Carlos; Fernández-Castillo, Noèlia; Agnetta, Luca; Decker, Michael; Lluch, José María; Hernando, Jordi; Loza-Álvarez, Pablo; Gorostiza, Pau (12/10/2023). "Estimulación infrarroja de tres fotones de neurorreceptores endógenos in vivo". Edición internacional Angewandte Chemie . doi : 10.1002/anie.202311181 . hdl : 2445/203764 . ISSN  1433-7851.