En bioquímica , la inmunotinción es cualquier uso de un método basado en anticuerpos para detectar una proteína específica en una muestra. El término "inmunotinción" se utilizó originalmente para referirse a la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido, como la describió por primera vez Albert Coons en 1941. [1] Sin embargo, la inmunotinción ahora abarca una amplia gama de técnicas utilizadas en histología , biología celular y biología molecular. que utilizan métodos de tinción basados en anticuerpos.
La inmunohistoquímica o tinción IHC de secciones de tejido (o inmunocitoquímica , que es la tinción de células ), es quizás la técnica de inmunotinción más comúnmente aplicada. [2] Mientras que en los primeros casos de tinción IHC se utilizaban tintes fluorescentes (ver inmunofluorescencia ), ahora se utilizan otros métodos no fluorescentes que utilizan enzimas como la peroxidasa (ver tinción con inmunoperoxidasa ) y la fosfatasa alcalina . Estas enzimas son capaces de catalizar reacciones que dan un producto coloreado que es fácilmente detectable mediante microscopía óptica . Alternativamente, se pueden utilizar elementos radiactivos como marcadores y la inmunorreacción se puede visualizar mediante autorradiografía . [3]
La preparación o fijación del tejido es esencial para la preservación de la morfología celular y la arquitectura del tejido. Una fijación inadecuada o prolongada puede disminuir significativamente la capacidad de unión del anticuerpo. Muchos antígenos pueden demostrarse con éxito en secciones de tejido incluidas en parafina y fijadas con formalina . Sin embargo, algunos antígenos no sobrevivirán ni siquiera a cantidades moderadas de fijación de aldehídos. En estas condiciones, los tejidos deben congelarse rápidamente en nitrógeno líquido y cortarse con un criostato. Las desventajas de las secciones congeladas incluyen una morfología deficiente, una resolución deficiente a mayores aumentos, dificultad para cortar secciones de parafina y la necesidad de almacenamiento congelado. Alternativamente, las secciones de vibratomo no requieren que el tejido se procese con disolventes orgánicos o altas temperaturas, que pueden destruir la antigenicidad o alterarla mediante congelación y descongelación. La desventaja de las secciones de vibratomo es que el proceso de corte es lento y difícil con tejidos blandos y mal fijados, y que a menudo son evidentes marcas de vibración o líneas de vibratomo en las secciones. [ cita necesaria ]
La detección de muchos antígenos puede mejorarse drásticamente mediante métodos de recuperación de antígenos que actúan rompiendo algunos de los enlaces cruzados de proteínas formados por la fijación para descubrir sitios antigénicos ocultos. Esto se puede lograr calentando durante períodos de tiempo variables (recuperación de epítopo inducida por calor o HIER) o usando digestión enzimática (recuperación de epítopo inducida por proteolíticos o PIER). [4]
Una de las principales dificultades de la tinción IHC es la superación de antecedentes específicos o inespecíficos. La optimización de los métodos y tiempos de fijación, el tratamiento previo con agentes bloqueantes, la incubación de anticuerpos con alto contenido de sal y la optimización de los tampones de lavado y los tiempos de lavado posteriores al anticuerpo son importantes para obtener una inmunotinción de alta calidad. Además, la presencia de controles positivos y negativos para la tinción es esencial para determinar la especificidad. [ cita necesaria ]
Se puede utilizar un citómetro de flujo para el análisis directo de células que expresan una o más proteínas específicas. Las células se inmunotiñen en solución utilizando métodos similares a los utilizados para la inmunofluorescencia y luego se analizan mediante citometría de flujo. [ cita necesaria ]
La citometría de flujo tiene varias ventajas sobre la IHC, entre ellas: la capacidad de definir distintas poblaciones de células por su tamaño y granularidad; la capacidad de eliminar las células muertas; sensibilidad mejorada; y análisis multicolor para medir varios antígenos simultáneamente. Sin embargo, la citometría de flujo puede ser menos efectiva para detectar poblaciones de células extremadamente raras y hay una pérdida de relaciones arquitectónicas en ausencia de una sección de tejido. [5] La citometría de flujo también tiene un alto costo de capital asociado con la compra de un citómetro de flujo. [ cita necesaria ]
La transferencia Western permite la detección de proteínas específicas a partir de extractos elaborados a partir de células o tejidos, antes o después de cualquier paso de purificación . Las proteínas generalmente se separan por tamaño mediante electroforesis en gel antes de transferirlas a una membrana sintética mediante métodos de transferencia seca, semiseca o húmeda. Luego, la membrana se puede sondear utilizando anticuerpos utilizando métodos similares a la inmunohistoquímica, pero sin necesidad de fijación. La detección se realiza normalmente utilizando anticuerpos unidos a peroxidasa para catalizar una reacción quimioluminiscente . [ cita necesaria ]
La transferencia Western es un método de biología molecular de rutina que se puede utilizar para comparar semicuantitativamente los niveles de proteína entre extractos. La separación por tamaños antes de la transferencia permite medir el peso molecular de la proteína en comparación con marcadores de peso molecular conocidos. [ cita necesaria ]
El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima o ELISA es un método de diagnóstico para determinar cuantitativa o semicuantitativamente concentraciones de proteínas a partir de plasma sanguíneo , suero o extractos de células/tejidos en un formato de placa de múltiples pocillos (generalmente 96 pocillos por placa). En términos generales, las proteínas en solución se absorben en placas ELISA. Se utilizan anticuerpos específicos para la proteína de interés para sondear la placa. El fondo se minimiza optimizando los métodos de bloqueo y lavado (como para IHC), y la especificidad se garantiza mediante la presencia de controles positivos y negativos. Los métodos de detección suelen ser colorimétricos o quimioluminiscentes. [ cita necesaria ]
Se puede utilizar microscopía electrónica o EM para estudiar la microarquitectura detallada de tejidos o células. Immuno-EM permite la detección de proteínas específicas en secciones de tejido ultrafinas. Los anticuerpos marcados con partículas de metales pesados (por ejemplo, oro) se pueden visualizar directamente mediante microscopía electrónica de transmisión . Si bien es poderosa para detectar la localización subcelular de una proteína, la inmuno-EM puede ser técnicamente desafiante, costosa y requerir una optimización rigurosa de los métodos de procesamiento y fijación de tejidos. Se propuso la biotinilación de proteínas in vivo para aliviar los problemas causados por la frecuente incompatibilidad de la tinción de anticuerpos con protocolos de fijación que preservan mejor la morfología celular. [6]
En los métodos de inmunotinción, se utiliza un anticuerpo para detectar un epítopo de proteína específico . Estos anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales . La detección de este anticuerpo primero o primario se puede lograr de múltiples maneras.
Como se describió anteriormente, enzimas como la peroxidasa de rábano picante o la fosfatasa alcalina se usan comúnmente para catalizar reacciones que dan un producto coloreado o quimioluminiscente . Las moléculas fluorescentes se pueden visualizar mediante microscopía de fluorescencia o microscopía confocal . [ cita necesaria ]
Las aplicaciones de la inmunotinción son numerosas, pero se utilizan con mayor frecuencia en diagnóstico clínico e investigación de laboratorio . [ cita necesaria ]
Clínicamente, la IHC se utiliza en histopatología para el diagnóstico de tipos específicos de cánceres basándose en marcadores moleculares. [ cita necesaria ]
In laboratory science, immunostaining can be used for a variety of applications based on investigating the presence or absence of a protein, its tissue distribution, its sub-cellular localisation, and of changes in protein expression or degradation.