La espectroscopia de resonancia magnética nuclear de proteínas (generalmente abreviada como RMN de proteínas ) es un campo de la biología estructural en el que se utiliza la espectroscopia de RMN para obtener información sobre la estructura y la dinámica de las proteínas , y también de los ácidos nucleicos y sus complejos. El campo fue iniciado por Richard R. Ernst y Kurt Wüthrich en la ETH , [1] y por Ad Bax , Marius Clore , Angela Gronenborn en el NIH , [2] y Gerhard Wagner en la Universidad de Harvard , entre otros. La determinación de la estructura por espectroscopia de RMN generalmente consta de varias fases, cada una de las cuales utiliza un conjunto separado de técnicas altamente especializadas. Se prepara la muestra, se realizan mediciones, se aplican enfoques interpretativos y se calcula y valida una estructura.
La RMN se ocupa de las propiedades mecánico-cuánticas del núcleo central (" núcleo ") del átomo. Estas propiedades dependen del entorno molecular local, y su medición proporciona un mapa de cómo están vinculados químicamente los átomos, qué tan cerca están en el espacio y qué tan rápido se mueven entre sí. Estas propiedades son fundamentalmente las mismas que las que se utilizan en la resonancia magnética (RM) , que es más conocida , pero las aplicaciones moleculares utilizan un enfoque algo diferente, apropiado para el cambio de escala de milímetros (de interés para los radiólogos) a nanómetros (los átomos enlazados están típicamente separados por una fracción de nanómetro), un factor de un millón. Este cambio de escala requiere una sensibilidad de detección y estabilidad mucho mayores para la medición a largo plazo. A diferencia de la RMN, los estudios de biología estructural no generan directamente una imagen, sino que se basan en cálculos informáticos complejos para generar modelos moleculares tridimensionales.
Actualmente, la mayoría de las muestras se examinan en una solución en agua, pero se están desarrollando métodos para trabajar también con muestras sólidas . La recopilación de datos se basa en colocar la muestra dentro de un imán potente, enviar señales de radiofrecuencia a través de la muestra y medir la absorción de esas señales. Dependiendo del entorno de los átomos dentro de la proteína, los núcleos de los átomos individuales absorberán diferentes frecuencias de señales de radio. Además, las señales de absorción de diferentes núcleos pueden verse perturbadas por núcleos adyacentes. Esta información se puede utilizar para determinar la distancia entre núcleos. Estas distancias, a su vez, se pueden utilizar para determinar la estructura general de la proteína.
Un estudio típico podría involucrar cómo dos proteínas interactúan entre sí, posiblemente con vistas al desarrollo de pequeñas moléculas que se puedan usar para investigar la biología normal de la interacción (" biología química ") o para proporcionar posibles pistas para uso farmacéutico ( desarrollo de fármacos ). Con frecuencia, el par de proteínas interactuantes puede haber sido identificado por estudios de genética humana, lo que indica que la interacción puede verse alterada por mutaciones desfavorables, o pueden desempeñar un papel clave en la biología normal de un organismo "modelo" como la mosca de la fruta, la levadura, el gusano C. elegans o los ratones. Para preparar una muestra, se utilizan típicamente métodos de biología molecular para hacer cantidades por fermentación bacteriana . Esto también permite cambiar la composición isotópica de la molécula, lo que es deseable porque los isótopos se comportan de manera diferente y proporcionan métodos para identificar señales de RMN superpuestas.
La resonancia magnética nuclear de proteínas se realiza en muestras acuosas de proteínas altamente purificadas . Por lo general, la muestra consta de entre 300 y 600 microlitros con una concentración de proteína en el rango de 0,1 a 3 milimolar . La fuente de la proteína puede ser natural o producida en un sistema de producción utilizando técnicas de ADN recombinante mediante ingeniería genética . Las proteínas expresadas de forma recombinante suelen ser más fáciles de producir en cantidad suficiente, y este método hace posible el marcaje isotópico . [ cita requerida ]
La proteína purificada se suele disolver en una solución tampón y se ajusta a las condiciones deseadas del disolvente. La muestra de RMN se prepara en un tubo de vidrio de pared fina . [ cita requerida ]
La RMN de proteínas utiliza experimentos de resonancia magnética nuclear multidimensional para obtener información sobre la proteína. Idealmente, cada núcleo distinto en la molécula experimenta un entorno electrónico distinto y, por lo tanto, tiene un desplazamiento químico distinto por el cual puede ser reconocido. Sin embargo, en moléculas grandes como las proteínas, el número de resonancias puede ser típicamente de varios miles y un espectro unidimensional inevitablemente tiene superposiciones incidentales. Por lo tanto, se realizan experimentos multidimensionales que correlacionan las frecuencias de núcleos distintos. Las dimensiones adicionales disminuyen la posibilidad de superposición y tienen un mayor contenido de información, ya que correlacionan señales de núcleos dentro de una parte específica de la molécula. La magnetización se transfiere a la muestra utilizando pulsos de energía electromagnética ( radiofrecuencia ) y entre núcleos utilizando retardos; el proceso se describe con las llamadas secuencias de pulsos . Las secuencias de pulsos permiten al experimentador investigar y seleccionar tipos específicos de conexiones entre núcleos. La variedad de experimentos de resonancia magnética nuclear que se utilizan en proteínas se divide en dos categorías principales: una en la que la magnetización se transfiere a través de los enlaces químicos y otra en la que la transferencia se produce a través del espacio, independientemente de la estructura del enlace. La primera categoría se utiliza para asignar los diferentes desplazamientos químicos a un núcleo específico, y la segunda se utiliza principalmente para generar las restricciones de distancia que se utilizan en el cálculo de la estructura y en la asignación con proteínas no marcadas. [ cita requerida ]
Dependiendo de la concentración de la muestra, el campo magnético del espectrómetro y el tipo de experimento, un único experimento de resonancia magnética nuclear multidimensional sobre una muestra de proteína puede llevar horas o incluso varios días para obtener una relación señal-ruido adecuada mediante el promedio de la señal y permitir una evolución suficiente de la transferencia de magnetización a través de las distintas dimensiones del experimento. En igualdad de condiciones, los experimentos de dimensiones superiores llevarán más tiempo que los de dimensiones inferiores. [ cita requerida ]
Por lo general, el primer experimento que se mide con una proteína marcada con isótopos es un espectro de correlación cuántica simple heteronuclear (HSQC) 2D, donde "heteronuclear" se refiere a núcleos distintos de 1H. En teoría, la correlación cuántica simple heteronuclear tiene un pico para cada H unido a un heteronúcleo. Por lo tanto, en el 15N-HSQC, con una proteína marcada con 15 N , se espera una señal para cada átomo de nitrógeno en la cadena principal, con la excepción de la prolina , que no tiene amida-hidrógeno debido a la naturaleza cíclica de su cadena principal. Las señales 15N-HSQC adicionales son aportadas por cada residuo con un enlace nitrógeno-hidrógeno en su cadena lateral (W, N, Q, R, H, K). El 15N-HSQC a menudo se conoce como la huella digital de una proteína porque cada proteína tiene un patrón único de posiciones de señal. El análisis del 15N-HSQC permite a los investigadores evaluar si está presente el número esperado de picos y, por lo tanto, identificar posibles problemas debido a conformaciones múltiples o heterogeneidad de la muestra. El experimento relativamente rápido de correlación cuántica única heteronuclear ayuda a determinar la viabilidad de realizar experimentos posteriores más largos, más costosos y más elaborados. No es posible asignar picos a átomos específicos solo a partir de la correlación cuántica única heteronuclear. [ cita requerida ]
Para analizar los datos de resonancia magnética nuclear, es importante obtener una asignación de resonancia para la proteína, es decir, averiguar qué desplazamiento químico corresponde a qué átomo. Esto se logra típicamente mediante un recorrido secuencial utilizando información derivada de varios tipos diferentes de experimentos de RMN. El procedimiento exacto depende de si la proteína está marcada isotópicamente o no, ya que muchos de los experimentos de asignación dependen del carbono-13 y el nitrógeno-15. [ cita requerida ]
Con proteínas no marcadas, el procedimiento habitual es registrar un conjunto de experimentos de resonancia magnética nuclear homonuclear bidimensional mediante espectroscopia de correlación (COSY), de los cuales varios tipos incluyen espectroscopia de correlación convencional, espectroscopia de correlación total (TOCSY) y espectroscopia de efecto Overhauser nuclear (NOESY). [3] [4] Un experimento de resonancia magnética nuclear bidimensional produce un espectro bidimensional. Las unidades de ambos ejes son desplazamientos químicos. El COSY y el TOCSY transfieren magnetización a través de los enlaces químicos entre protones adyacentes. El experimento de espectroscopia de correlación convencional solo puede transferir magnetización entre protones en átomos adyacentes, mientras que en el experimento de espectroscopia de correlación total los protones pueden transmitir la magnetización, por lo que se transfiere entre todos los protones que están conectados por átomos adyacentes. Así, en una espectroscopia de correlación convencional, un protón alfa transfiere magnetización a los protones beta, los protones beta transfieren a los protones alfa y gamma, si hay alguno presente, luego el protón gamma transfiere a los protones beta y delta, y el proceso continúa. En la espectroscopia de correlación total, el alfa y todos los demás protones pueden transferir magnetización a los protones beta, gamma, delta y épsilon si están conectados por una cadena continua de protones. La cadena continua de protones es la cadena lateral de los aminoácidos individuales . Por lo tanto, estos dos experimentos se utilizan para construir los llamados sistemas de espín, es decir, construir una lista de resonancias del desplazamiento químico del protón peptídico, los protones alfa y todos los protones de la cadena lateral de cada residuo . Los desplazamientos químicos que corresponden a qué núcleos en el sistema de espín se determinan mediante las conectividades de la espectroscopia de correlación convencional y el hecho de que los diferentes tipos de protones tienen desplazamientos químicos característicos. Para conectar los diferentes sistemas de espín en un orden secuencial, se debe utilizar el experimento de espectroscopia de efecto Overhauser nuclear. Debido a que este experimento transfiere magnetización a través del espacio, mostrará picos cruzados para todos los protones que están cerca en el espacio independientemente de si están en el mismo sistema de espín o no. Los residuos vecinos están inherentemente cerca en el espacio, por lo que las asignaciones se pueden realizar por los picos en el NOESY con otros sistemas de espín. [ cita requerida ]
Un problema importante que presenta la resonancia magnética nuclear homonuclear es la superposición entre picos. Esto ocurre cuando diferentes protones tienen desplazamientos químicos iguales o muy similares. Este problema se agrava a medida que la proteína se hace más grande, por lo que la resonancia magnética nuclear homonuclear suele restringirse a proteínas o péptidos pequeños. [ cita requerida ]
El experimento 15N que se realiza con más frecuencia es el 1 H- 15 N HSQC. El experimento es muy sensible y, por lo tanto, se puede realizar con relativa rapidez. A menudo se utiliza para comprobar la idoneidad de una proteína para la determinación de la estructura mediante RMN, así como para la optimización de las condiciones de la muestra. Es uno de los experimentos estándar que se utilizan para la determinación de la estructura de la solución de la proteína. El HSQC se puede ampliar aún más a experimentos de RMN tridimensionales y cuatridimensionales, como el 15 N-TOCSY-HSQC y el 15 N-NOESY-HSQC. [5]
Cuando la proteína está marcada con carbono-13 y nitrógeno-15 es posible registrar experimentos de triple resonancia que transfieren magnetización sobre el enlace peptídico, y así conectan diferentes sistemas de espín a través de enlaces. [6] [7] Esto se hace usualmente usando algunos de los siguientes experimentos, HNCO , HN(CA)CO }, HNCA , [8] HN(CO)CA , HNCACB y CBCA(CO)NH . Los seis experimentos consisten en un plano 1 H- 15 N (similar a un espectro HSQC) expandido con una dimensión de carbono. En el HN(CA)CO , cada plano H N contiene los picos del carbono carbonílico de su residuo así como el precedente en la secuencia. El HNCO contiene el desplazamiento químico del carbono carbonílico solo del residuo precedente, pero es mucho más sensible que el HN(CA)CO . Estos experimentos permiten que cada pico 1 H- 15 N se enlace con el carbono carbonílico precedente, y luego se puede realizar la asignación secuencial haciendo coincidir los cambios de los carbonos propios y previos de cada sistema de espín. El HNCA y el HN(CO)CA funcionan de manera similar, solo que con los carbonos alfa (C α ) en lugar de los carbonilos, y el HNCACB y el CBCA(CO)NH contienen tanto el carbono alfa como el carbono beta (C β ). Por lo general, se requieren varios de estos experimentos para resolver la superposición en la dimensión del carbono. Este procedimiento suele ser menos ambiguo que el método basado en NOESY, ya que se basa en la transferencia de enlaces pasantes. En los métodos basados en NOESY, aparecerán picos adicionales correspondientes a átomos que están cerca en el espacio pero que no pertenecen a residuos secuenciales, lo que confunde el proceso de asignación. Después de la asignación de resonancia secuencial inicial, generalmente es posible extender la asignación de C α y C β al resto de la cadena lateral utilizando experimentos como HCCH-TOCSY, que es básicamente un experimento TOCSY resuelto en una dimensión de carbono adicional.
Para realizar los cálculos de la estructura, es necesario generar una serie de restricciones determinadas experimentalmente. Estas se dividen en diferentes categorías; las más utilizadas son las restricciones de distancia y las restricciones de ángulo.
Un pico cruzado en un experimento NOESY significa proximidad espacial entre los dos núcleos en cuestión. Por lo tanto, cada pico se puede convertir en una distancia máxima entre los núcleos, generalmente entre 1,8 y 6 angstroms . La intensidad de un pico NOESY es proporcional a la distancia elevada a la menos 6ª potencia, por lo que la distancia se determina de acuerdo con la intensidad del pico. La relación intensidad-distancia no es exacta, por lo que generalmente se utiliza un rango de distancia.
Es de gran importancia asignar los picos NOESY a los núcleos correctos en función de los desplazamientos químicos. Si esta tarea se realiza manualmente, suele ser muy laboriosa, ya que las proteínas suelen tener miles de picos NOESY. Algunos programas informáticos como PASD [9] [10] / XPLOR-NIH , [11] [12] UNIO, [13] CYANA , [14] ARIA [15] / CNS , [16] y AUDANA [17] /PONDEROSA-C/S [18] en la plataforma Integrative NMR [19] realizan esta tarea automáticamente en listados preprocesados manualmente de posiciones de picos y volúmenes de picos, acoplados a un cálculo de estructura. Hasta ahora, el acceso directo a los datos NOESY sin procesar, sin la engorrosa necesidad de refinar iterativamente las listas de picos, solo lo garantiza el algoritmo PASD [10] implementado en XPLOR-NIH , [11] el enfoque ATNOS/CANDID implementado en el paquete de software UNIO, [13] y PONDEROSA-C/S, y por lo tanto garantiza un análisis espectral NOESY objetivo y eficiente.
Para obtener asignaciones lo más precisas posibles, es una gran ventaja tener acceso a los experimentos NOESY de carbono-13 y nitrógeno-15, ya que ayudan a resolver la superposición en la dimensión del protón. Esto conduce a asignaciones más rápidas y confiables y, a su vez, a mejores estructuras.
Además de las restricciones de distancia, se pueden generar restricciones en los ángulos de torsión de los enlaces químicos, típicamente los ángulos psi y phi . Un enfoque es utilizar la ecuación de Karplus para generar restricciones de ángulo a partir de las constantes de acoplamiento . Otro enfoque utiliza los desplazamientos químicos para generar restricciones de ángulo. Ambos métodos utilizan el hecho de que la geometría alrededor del carbono alfa afecta las constantes de acoplamiento y los desplazamientos químicos, por lo que, dadas las constantes de acoplamiento o los desplazamientos químicos, se puede hacer una suposición calificada sobre los ángulos de torsión.
Las moléculas de analito en una muestra pueden ordenarse parcialmente con respecto al campo magnético externo del espectrómetro manipulando las condiciones de la muestra. Las técnicas comunes incluyen la adición de bacteriófagos o bicelas a la muestra, o la preparación de la muestra en un gel de poliacrilamida estirado . Esto crea un entorno local que favorece ciertas orientaciones de moléculas no esféricas. Normalmente, en la RMN en solución, los acoplamientos dipolares entre núcleos se promedian debido al rápido movimiento de la molécula. La ligera superpoblación de una orientación significa que queda por observar un acoplamiento dipolar residual . El acoplamiento dipolar se utiliza comúnmente en la RMN de estado sólido y proporciona información sobre la orientación relativa de los vectores de enlace en relación con un único marco de referencia global. Normalmente, la orientación del vector NH se investiga en un experimento similar al HSQC. Inicialmente, se utilizaron acoplamientos dipolares residuales para el refinamiento de estructuras determinadas previamente, pero también se han realizado intentos de determinación de la estructura de novo. [20]
La espectroscopia de RMN es específica del núcleo. Por lo tanto, puede distinguir entre hidrógeno y deuterio. Los protones de amida en la proteína se intercambian fácilmente con el disolvente y, si el disolvente contiene un isótopo diferente, normalmente deuterio , la reacción se puede controlar mediante espectroscopia de RMN. La rapidez con la que se intercambia una amida determinada refleja su accesibilidad al disolvente. Por lo tanto, las tasas de intercambio de amida pueden proporcionar información sobre qué partes de la proteína están enterradas, unidas por enlaces de hidrógeno, etc. Una aplicación común es comparar el intercambio de una forma libre frente a un complejo. Se supone que las amidas que quedan protegidas en el complejo están en la interfaz de interacción.
Las restricciones determinadas experimentalmente se pueden utilizar como entrada para el proceso de cálculo de la estructura. Los investigadores, utilizando programas informáticos como XPLOR-NIH , [11] CYANA , GeNMR o RosettaNMR [21] intentan satisfacer la mayor cantidad posible de restricciones, además de las propiedades generales de las proteínas, como las longitudes y los ángulos de enlace. Los algoritmos convierten las restricciones y las propiedades generales de las proteínas en términos de energía y luego intentan minimizar esta energía. El proceso da como resultado un conjunto de estructuras que, si los datos fueran suficientes para dictar un cierto plegamiento, convergerían.
El conjunto de estructuras obtenidas es un "modelo experimental", es decir, una representación de un determinado tipo de datos experimentales. Reconocer este hecho es importante porque significa que el modelo puede ser una buena o mala representación de esos datos experimentales. [22] En general, la calidad de un modelo dependerá tanto de la cantidad como de la calidad de los datos experimentales utilizados para generarlo y de la correcta interpretación de dichos datos.
Todo experimento tiene errores asociados. Los errores aleatorios afectarán la reproducibilidad y precisión de las estructuras resultantes. Si los errores son sistemáticos, la precisión del modelo se verá afectada. La precisión indica el grado de reproducibilidad de la medición y a menudo se expresa como la varianza del conjunto de datos medidos en las mismas condiciones. La exactitud, sin embargo, indica el grado en que una medición se acerca a su valor "verdadero".
Idealmente, un modelo de una proteína será más preciso cuanto más se ajuste la molécula real que representa y será más preciso cuanto menos incertidumbre haya sobre las posiciones de sus átomos. En la práctica no existe una "molécula estándar" con la que comparar modelos de proteínas, por lo que la precisión de un modelo viene dada por el grado de acuerdo entre el modelo y un conjunto de datos experimentales. Históricamente, las estructuras determinadas por RMN han sido, en general, de menor calidad que las determinadas por difracción de rayos X. Esto se debe, en parte, a la menor cantidad de información contenida en los datos obtenidos por RMN. Debido a este hecho, se ha convertido en una práctica común establecer la calidad de los conjuntos de RMN, comparándolos con la conformación única determinada por difracción de rayos X, para la misma proteína. Sin embargo, la estructura de difracción de rayos X puede no existir y, dado que las proteínas en solución son moléculas flexibles, una proteína representada por una única estructura puede llevar a subestimar la variación intrínseca de las posiciones atómicas de una proteína. Un conjunto de conformaciones, determinado por RMN o cristalografía de rayos X, puede ser una mejor representación de los datos experimentales de una proteína que una conformación única. [23]
La utilidad de un modelo vendrá dada, al menos en parte, por el grado de exactitud y precisión del modelo. Un modelo exacto con una precisión relativamente pobre podría ser útil para estudiar las relaciones evolutivas entre las estructuras de un conjunto de proteínas, mientras que el diseño racional de fármacos requiere modelos tanto precisos como exactos. Un modelo que no sea exacto, independientemente del grado de precisión con el que se haya obtenido, no será muy útil. [22] [24]
Dado que las estructuras de las proteínas son modelos experimentales que pueden contener errores, es muy importante poder detectar estos errores. El proceso destinado a la detección de errores se conoce como validación. Existen varios métodos para validar estructuras, algunos son estadísticos como PROCHECK y WHAT IF mientras que otros se basan en principios físicos como CheShift , o una mezcla de principios estadísticos y físicos PSVS.
Además de las estructuras, la resonancia magnética nuclear puede proporcionar información sobre la dinámica de varias partes de la proteína . Esto generalmente implica medir los tiempos de relajación, como T 1 y T 2, para determinar los parámetros de orden, los tiempos de correlación y las tasas de intercambio químico. La relajación de RMN es una consecuencia de los campos magnéticos fluctuantes locales dentro de una molécula. Los campos magnéticos fluctuantes locales son generados por los movimientos moleculares. De esta manera, las mediciones de los tiempos de relajación pueden proporcionar información de los movimientos dentro de una molécula a nivel atómico. En los estudios de RMN de la dinámica de las proteínas, el isótopo nitrógeno-15 es el núcleo preferido para estudiar porque sus tiempos de relajación son relativamente simples de relacionar con los movimientos moleculares. Sin embargo, esto requiere el etiquetado isotópico de la proteína. Los tiempos de relajación T 1 y T 2 se pueden medir utilizando varios tipos de experimentos basados en HSQC . Los tipos de movimientos que se pueden detectar son movimientos que ocurren en una escala de tiempo que varía de aproximadamente 10 picosegundos a aproximadamente 10 nanosegundos. Además, también se pueden estudiar movimientos más lentos, que tienen lugar en una escala de tiempo que va desde unos 10 microsegundos a 100 milisegundos. Sin embargo, dado que los átomos de nitrógeno se encuentran principalmente en la estructura principal de una proteína, los resultados reflejan principalmente los movimientos de la estructura principal, que es la parte más rígida de una molécula de proteína. Por lo tanto, los resultados obtenidos a partir de las mediciones de relajación del nitrógeno-15 pueden no ser representativos de la proteína completa. Por lo tanto, recientemente se han desarrollado técnicas que utilizan mediciones de relajación del carbono-13 y del deuterio , lo que permite estudios sistemáticos de los movimientos de las cadenas laterales de aminoácidos en las proteínas. Un caso de estudio desafiante y especial con respecto a la dinámica y flexibilidad de los péptidos y las proteínas de longitud completa está representado por las estructuras desordenadas. Hoy en día, es un concepto aceptado que las proteínas pueden exhibir un comportamiento más flexible conocido como desorden o falta de estructura; sin embargo, es posible describir un conjunto de estructuras en lugar de una imagen estática que represente un estado completamente funcional de la proteína. En este campo se han producido numerosos avances, en particular en términos de nuevas secuencias de pulsos, mejoras tecnológicas y formación rigurosa de investigadores en este campo.
Tradicionalmente, la espectroscopia de resonancia magnética nuclear se ha limitado a proteínas o dominios proteicos relativamente pequeños. Esto se debe en parte a problemas para resolver picos superpuestos en proteínas más grandes, pero esto se ha aliviado con la introducción del marcaje isotópico y los experimentos multidimensionales. Otro problema más serio es el hecho de que en proteínas grandes la magnetización se relaja más rápido, lo que significa que hay menos tiempo para detectar la señal. Esto a su vez hace que los picos se vuelvan más anchos y débiles, y finalmente desaparezcan. Se han introducido dos técnicas para atenuar la relajación: la espectroscopia optimizada por relajación transversal (TROSY) [25] y la deuteración [26] de proteínas. Mediante el uso de estas técnicas ha sido posible estudiar proteínas en complejo con la chaperona de 900 kDa GroES - GroEL . [27] [28]
La determinación de la estructura por RMN ha sido tradicionalmente un proceso que consume mucho tiempo, que requiere un análisis interactivo de los datos por parte de un científico altamente capacitado. Ha habido un interés considerable en automatizar el proceso para aumentar el rendimiento de la determinación de la estructura y hacer que la RMN de proteínas sea accesible para los no expertos (véase genómica estructural ). Los dos procesos que consumen más tiempo son la asignación de resonancia específica de la secuencia (asignación de la cadena principal y lateral) y las tareas de asignación de NOE. Se han publicado varios programas informáticos diferentes que se centran en partes individuales del proceso general de determinación de la estructura por RMN de forma automatizada. La mayor parte del progreso se ha logrado en la tarea de asignación automatizada de NOE. Hasta ahora, solo se propusieron los enfoques FLYA y UNIO para realizar todo el proceso de determinación de la estructura de la proteína por RMN de forma automatizada sin ninguna intervención humana. [13] [14] Los módulos en el NMRFAM-SPARKY como APES (código de dos letras: ae), I-PINE/PINE-SPARKY (código de dos letras: ep; servidor web I-PINE) y PONDEROSA (código de dos letras: c3, up; servidor web PONDEROSA) están integrados de modo que ofrecen una automatización completa con capacidad de verificación visual en cada paso. [29] También se han hecho esfuerzos para estandarizar el protocolo de cálculo de la estructura para hacerlo más rápido y más susceptible de automatización. [30] Recientemente, se ha lanzado la suite POKY, el sucesor de los programas mencionados anteriormente, para proporcionar herramientas GUI modernas y funciones AI/ML. [31]
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